桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

枇杷EjNAC82的克隆及其对类胡萝卜素合成基因EjPSY、EjBCH的转录激活分析

为了探讨NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素代谢的调控机制,以大红袍(红肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)为试验材料,利用RNA-Seq技术对大红袍和白沙进行转录组测序,通过分析两个品种间的转录组差异,初步筛选并克隆出了1个枇杷NAC转录因子,命名为EjNAC82。生物信息学技术分析结果发现,EjNAC82具有NAC转录因子特有的结构域、理化性质和蛋白质结构特点,是典型的NAC转录因子家族基因。亚细胞定位试验发现该转录因子定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,EjNAC82在枇杷老叶中的表达量高于根、芽、嫩叶、老叶、嫩枝、老枝、幼果和熟果。EjNAC82在果皮和果肉成熟过程中的表达模式相同,均呈先上升后下降再上升的趋势。随着果实的成熟,EjNAC82在大红袍果肉中的表达显著高于白沙(P<0.05)。EjNAC82在大红袍果皮S1、S2、S4时期的表达显著高于白沙。LUC/REN双荧光素酶试验结果表明,EjNAC82对EjPSY1、EjPSY2和EjBCH启动子具有激活作用。这些结果表明EjNAC82可能通过调控EjPSY1、EjPSY2和EjBCH基因的表达从而正向调控枇杷果实中类胡萝卜素的合成。本研究结果为揭示NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素积累的转录调控功能提供了理论依据。     

桃MPK3基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究MPK3响应GA信号调控休眠解除的分子机理,以中油四号油桃为试验材料,通过实时荧光定量PCR发现GA诱导下MAPKs家族基因在桃芽中有不同程度的表达,其中PpMPK3响应GA正调控表现最强烈。利用MEGA6.0、MEME、GSDS、DNAMAN 6.0等软件对桃PpMPK3基因进行生物信息学分析,结果表明,PpMPK3的cDNA全长1 113 bp,编码370个氨基酸,蛋白分子量约为42.6 kD,理论等电点为5.62,属于亲水性不稳定蛋白。预测PpMPK3蛋白发生磷酸化修饰的位点有45个,不存在糖基化位点。PpMPK3蛋白的二级结构中α-螺旋占41.35%,延伸链占10.54%,无规则卷曲为48.11%。进化树分析表明,PpMPK3氨基酸序列与甜樱桃亲缘关系最近,同源性为99.73%。通过亚细胞定位发现,PpMPK3定位于细胞核。RT-PCR结果表明,PpMPK3的表达模式与休眠解除过程相一致,推测PpMPK3能够响应GA信号,促进休眠解除。本研究结果为桃设施栽培的休眠调控提供了一定的理论依据。     

桃蔗糖酶基因的克隆和差异表达

以桃（Prunus persica)基因组DNA为模板,通过PCR方法得到含0.75kb的特异性条带,将其克隆到加T尾pBluescrips SK载体上,筛选到重组克隆,用限制性内切酶酶切鉴定至少可分为两组,一组是插入片段无HindⅢ位点,一组是据入片段有HindⅢ位点。对两组pPIN02和pPIN04克隆插入片段两端进行核苷酸序列分析表明,pPIN02和pPIN04插入片段全长744个碱基,编码248个氨基酸,核苷酸和氨基酸同源性分别为70．7％和75．9％。与其它植物蔗糖酶氨基酸序列同源性约为60％－72％。RNA点杂交表明pPIN02和pPIN04在果实都能表达,但表达模式有所不同。     

桃PpMADS1的克隆及对类胡萝卜素合成基因的调控研究

为探究桃MADS转录因子基因的序列特征、表达模式及其对类胡萝卜素合成的调控作用,本研究从桃果实中克隆得到一个MADS-box家族基因,命名为PpMADS1.结果 表明,PpMADS1的开放阅读框(ORF)为732 bp,编码243个氨基酸,蛋白具有亲水性,稳定性较差,其二级结构以α-螺旋为主要构成元件,且与三级结构相似...     

桃叶片伤诱导ACC氧化酶基因cDNA的克隆,序列分析其在大肠杆？…

以桃ＡＣＣ氧化酶基因和ＤＮＡ为探针,与伤处理诱导后桃叶片总ＲＮＡ进行点杂交,结果表明,未经伤处理的样品示能检测杂杂交信号,伤处理后２－４ｈ左右信号达到最强,将其样品ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,通过反转录聚合酶链式反应得到一条０．９５ｋｂ的特异性扩增产物,该扩增产物能与桃ＡＣＣ氧化酶基因组探针杂交。     

花特异表达启动子PchsA的克隆及其序列分析

根据Ingrid M报道的矮牵牛花特异表达基因CHS A启动子的序列设计并合成一对特异引物，以矮牵牛（Petunia hybrida）叶片总DNA为模板，通过PCR扩增获得约含0.5kb大小的DNA片段，回收该片段并克隆到pGEM^R-T Easy载体上，进行测序，该片段含514bp。采用pcgene软件进行启动子序列结构的分析，第401－407之间有一个TATA box，第52－62位碱基间有一个CCAAT box，第429－434之间有一戴帽位点（cap site)，第21－36个碱基间有一个anther blox，第303－320位碱基间有一个box2元件，第335－349位碱基间有一个box1元件，box1元件内包含有一个G－box，第362－267之间还有一下G－box，第370－382之间有2个拷贝的TACPyAT box，所有这些调控元件及其附近的序列与报道的序列完全一致。但该序列在第78－248个碱基间比报道序列多出一段171bp的序列，经Splice site prediction分析，在第146－250bp之间为一内含子的序列（105bp)。     

桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究从桃中克隆PpWRKY18基因,通过生物信息学分析PpWRKY18蛋白含有典型WRKY功能结构域。系统进化树分析表明,桃PpWRKY18与蔷薇科物种的亲缘关系最为相近。生物信息学预测PpWRKY18蛋白定位细胞核,并通过农杆菌瞬时注射烟草叶片证实PpWRKY18定位于细胞核。对PGEX-PpWRKY18融合蛋白进行诱导表达,发现PpWRKY18融合蛋白主要在包涵体中表达。荧光定量PCR结果表明,PpWRKY18受干旱诱导表达量上升,复水后PpWRKY18表达量下降。生物信息学预测显示,蛋白磷酸酶蛋白家族(Protein Phosphatase 2C)、C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF蛋白家族(PpERF9)、BHLH蛋白家族(PpBHLH92)可能与PpWRKY18蛋白互作,推测PpWRKY18蛋白通过与这些蛋白互作协同响应干旱胁迫。本研究为探索PpWRKY18响应干旱的分子机制提供了理论依据。     

桃已知MADS-box转录因子的生物信息学及花发育表达分析

MADS-box基因家族是研究最广泛的植物转录因子之一,参与调控植物生长和发育的多个过程.本文列举了当前已知的MADS-box(PpMADS)基因在桃(Prunus persica)功能基因组数据库中的基本信息,对PpMADS基因的保守结构域、进化关系、内含子与外显子、染色体定位和保守元件进行了详细分析;并利用半定量RT-PCR技术分析了其在不同花器官中和的花的不同发育阶段表达水平.结果表明,PpMADS在桃不同花器官、花不同发育期中起重要的调控作用,为进一步筛选PpMADS基因进行功能分析奠定相关理论基础.     

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

黑田五寸胡萝卜中3个Orange基因的克隆与表达分析

在植物中Orange (Or) 蛋白对类胡萝卜素的生物合成和积累具有重要的作用。对胡萝卜全基因组分析后鉴定到3个Or基因,为分析3个Or基因与类胡萝卜素合成的相关性,以橙色胡萝卜品种黑田五寸为研究材料,克隆得到3个Or基因,并对其进行生物信息学分析及实时荧光定量(qRT-PCR)分析。序列分析表明,DcOr1、DcOr2和DcOr3的开放阅读框(ORF)全长分别为933、858 和939 bp,分别编码310、285和312个氨基酸;推测的氨基酸序列含有4个高度保守的富含半胱氨酸区域。DcOr1和DcOr3均由8个外显子和7个内含子组成,DcOr2由7个外显子和6个内含子组成。进化树分析显示,DcOr1与DcOr2进化关系最近,而DcOr3与三裂叶薯Or蛋白(XP_031112030.1)进化关系最近。qRT-PCR结果表明,3个DcOr基因在30、60、90和120 d的胡萝卜根中均有表达,其中DcOr2的相对表达量最低,DcOr3在各个阶段的相对表达量都为最高,在90 d时达到峰值,且相对表达量趋势与DcPSY1和DcPSY2最接近,推测DcOr3与胡萝卜类胡萝卜素合成最相关。本研究为探究胡萝卜生长发育过程中类胡萝卜素的生物合成机制提供了一定的理论依据。     

含钼袋控复混缓释肥对土壤酶活性及桃树植株生长的影响

以2年生瑞蟠21/毛桃为试材,通过调控袋控复混缓释肥钼元素含量(0 g/袋:普通袋控复混缓释肥;0.1 g/袋:含钼袋控复混缓释肥),探究含钼袋控复混缓释肥对盆栽桃树土壤酶活性、养分吸收及植株生长的影响。结果表明,与普通袋控复混缓释肥相比,含钼袋控复混缓释肥处理显著提高土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性,施肥后30,60天分别提高6.99%,7.61%,12.27%,22.86%和6.31%,11.58%,9.05%,32.14%,且差异显著;含钼袋控复混缓释肥处理提高土壤中全钼含量,增加侧根数量,与普通袋控复混缓释肥相比,根系活力、总根长、总表面积和总体积分别提高7.88%,6.12%,3.95%和9.19%;根冠比提高6.92%,干物质总量提高9.99%。与普通袋控复混缓释肥处理相比,含钼袋控复混缓释肥处理植株叶、侧枝和根部全钼、全氮和全磷含量显著提高,但全钾含量无显著差异,并提高叶、侧枝和根部钙、镁、锌和硼等元素含量;显著提高桃树叶片叶绿素含量和净光合速率。研究表明,含钼袋控复混缓释肥可提高土壤酶活性和桃幼树根系活力,增加侧根数量,提高根冠比,并提高植株叶片净光合效率,促进桃树对氮、磷、硼和锌等元素的吸收,从而促进桃树植株的形态建成。     

外源褪黑素对低温胁迫下桃果实蔗糖代谢的影响

为探究外源褪黑素减轻桃果实低温冷害发生的机制,以湖景蜜露水蜜桃果实为材料,研究了100μmol·L~(-1)外源褪黑素处理对桃果实采后4℃贮藏期间可溶性糖含量及蔗糖代谢相关酶基因表达的影响。结果表明,100μmol·L~(-1)外源褪黑素能显著减轻果实冷害的症状,保持较高水平的蔗糖和葡萄糖含量。RT-q PCR分析表明,外源褪黑素处理抑制了蔗糖代谢相关酶基因Pp SPS3、Pp SPP1、Pp SUS1、Pp SUS5、PpHK1、Pp FK1和Pp FK3的表达,提高了蔗糖合成相关酶基因Pp SPS1、Pp SPS2、Pp SUT1和Pp NI1的表达水平,维持果实较高的蔗糖和葡萄糖含量,从而提高了桃果实的抗冷性和贮藏品质。本研究结果为揭示外源褪黑素减轻桃果实低温冷害发生的机制提供了新的思路。     

烟草NtMTPC4启动子的克隆与缺失分析

组织特异性启动子是基因工程研究及实际应用中的重要工具。为了研究烟草NtMTPC4启动子的表达特性,采用实时荧光定量PCR方法分析烟草金属耐受蛋白C4(MTPC4)基因NtMTPC4在烟草不同组织中的表达模式,并利用PCR技术克隆得到NtMTPC4的上游启动子NtMTPC4-P。根据调控元件的分布对NtMTPC4-P进行不同程度的缺失,获得了NtMTPC4-P1、NtMTPC4-P2和NtMTPC4-P3缺失体;构建全长NtMTPC4-P和不同缺失体的植物表达载体,并通过花序浸染法转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析。结果表明,NtMTPC4基因的表达具有组织特异性,其在花中的表达量最高。NtMTPC4-P全长2 287 bp,含有CAAT-box、TATA-box、GTGANTG10和POLLEN1LELAT52等顺式作用元件和调控元件。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子NtMTPC4-P和不同缺失体都能特异性地驱动GUS基因在转基因拟南芥花粉中的表达。本研究结果为通过基因工程技术在花粉中特异表达目的基因提供了新的调控元件。     

猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)启动子克隆及其分析

本研究旨在对猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)的转录调控机制进行初步探讨.首先通过PCR方法扩增MC4R基因5’上游启动区l 234 bp(-1 264～-31 bp)的片段,再利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,最后采用步移缺失获得了11段长度不等的启动子片段,并分别克隆到荧光素酶(LUC)报告基因表达质粒(pGL3-Basic)中.同时,通过双荧光素酶报告活性分析检测MC4R基因启动子区不同长度片段在猪上皮型肾细胞(PK15)中瞬时转染后的活性.结果表明,猪MC4R 5’端-682 bp处存在1个潜在的转录起始位点(TSS),细胞检测结果显示-514～-486bp区域内存在控制MC4R基础转录活性的顺式调控元件,推测该序列内的热休克转录因子(HSF)结合位点可能对MC4R基因的表达调控及功能行使具有重要作用.