EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的 :探索能获得较多成年大鼠神经干细胞克隆及其分化后产生较多神经元的方法。方法 :取成年SD大鼠前脑室下区(SVZ)组织 ,接种于 2 4孔培养板中 ,实验分成EGF、bFGF和EGF +bFGF三组 ,观察克隆球的形成情况。 7天后一部分克隆球消化成单细胞悬液后进行BrdU标记及免疫荧光检测 ;另一部分克隆球在含血清的培养液中进行贴壁分化 ,14天后 ,分别用MAP -2和GFAP的单克隆抗体进行免疫荧光标记。结果 :原代培养EGF组培养液中克隆球的数量少 ,克隆球直径也小 ;bFGF组和EGF +bFGF组培养液中克隆球的数量多 ,克隆球也较大。bFGF组和EGF +bFGF组MAP -2阳性神经元的数量明显多于EGF组 ,而EGF组中可见到能产生较多的GFAP阳性细胞。结论 :bFGF较EGF更能促进神经干细胞增殖 ,并可诱导神经干细胞较多地向神经元分化     

异丙酚促进体外培养的成年大鼠海马神经干细胞增殖

目的 异丙酚对于成年神经干细胞增殖能力的影响目前尚不明确,本研究对异丙酚对体外培养的大鼠成年神经干细胞的作用及其可能的分子机制进行了研究.方法 体外培养的大鼠成年神经干细胞给予BrdU后,分别用10、50、100μg/ml的异丙酚进行处理,并同时设立溶媒对照和空白对照.24 h后.采用免疫染色显示BrdU阳性细胞,DAPI复染细胞核.细胞存活率采用细胞计数法和MTT法测定.人工计数BrdU阳性细胞和固缩细胞核的比例.用Fura 2-AM检测胞浆内Ca2+浓度.分别用免疫荧光和免疫印迹法检测细胞内CREB和磷酸化CREB的表达位置和水平.结果 低浓度(10μg/ml)异丙酚不能促进大鼠成年神经干细胞的增殖.而中浓度(50μg/ml)和高浓度异丙酚(100μg/ml)则呈剂量依赖性的促进其增殖.异丙酚提高了BrdU阳性细胞的比例.细胞死亡率在处理前后维持在低水平上(<2%).异丙酚显著提高了大鼠成年神经干细胞胞浆内的游离Ca2+浓度.异丙酚处理前后,大鼠成年神经干细胞均能表达CREB和磷酸化CREB,但是异丙酚干预后,大鼠成年神经干细胞内磷酸化CREB表达水平显著增高.结论 异丙酚可促进体外培养的大鼠成年神经干细胞的增殖水平,这是细胞存活率升高的主要原因,可能与胞浆内Ca2+浓度以及CREB磷酸化水平的升高有关.     

大鼠脑梗死后室周带神经干细胞增殖和迁移

目的：研究成年大鼠脑梗死后室周带神经干细胞的增殖及迁移。方法：制作大鼠脑梗死模型，将其分为脑梗死后3、5、7和14d组，对照组为假手术组：采用免疫组化法动态检测大鼠脑内5-溴脱氧尿苷嘧啶（BrdU）、双皮质素（DCX）的表达。结果：与对照组相比，室周带BrdU阳性细胞在脑梗死后逐渐增加，并于7d达高峰，14d后开始下降，但仍高于正常水平。梗死后不同时间组室周带BrdU阳性细胞数均高于对照组（P〈0．01）。DCX阳性细胞具有迁移细胞的形态学特征，并向损伤区迁移，于术后5d迁移细胞的数量达高峰。结论：脑梗死可激活室周带神经干细胞原位增殖，并向损伤区迁移。     

嗅球损伤对成年大鼠脑室下区神经干细胞增殖和NMDA受体亚单位2B表达的影响

目的 研究嗅球损伤对成年大鼠脑室下区（SVZ）神经干细胞增殖和NMDA受体亚单位2B表达的影响.方法 正常成年雌性SD大鼠60只,随机分成正常对照组、生理盐水组、嗅球损伤组,嗅球内局部注射N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）制作嗅球损伤模型,术后分3d、7d、14 d、28 d四个时间点取脑.行免疫组织化学染色观察神经干细胞（Nestin）、增殖细胞（Ki67）及NMDA受体亚单位NR2B阳性细胞数.结果 （1）各组大鼠SVZ均可见Nestin阳性细胞,嗅球损伤后7 d Nestin IOD值增加[（29601±1788）/0.01 mm2,P＜0.05],14 d达到高峰[（31400±3435）/0.01 mm2,P＜0.05],28 d后有所下降[（27600±3209）/0.01 mm2,P＜0.05].（2）各组大鼠SVZ均表达Ki67阳性细胞,嗅球损伤后7d、14 d和28 d SVZ Ki67阳性细胞数分别为[（28.60±2.41）/0.01 mm2]、[（34.00±2.55）/0.01 mm2]、[（30.40±1.14）/0.01 mm2],显著高于正常组和生理盐水组阳性细胞数（P＜0.05）.（3）各组大鼠SVZ均表达NR2B阳性细胞,嗅球损伤3d,NR2B阳性细胞数开始增加[（58.80±2.95）个/0.01 mm2,P＜0.05],14 d达到高峰[（68.40±4.04）个/0.01 mm2,P＜0.05],28 d阳性细胞数有所下降,但维持较高的水平[（62.20±3.56）个/0.01 mm2,P＜0.05].（4）嗅球损伤后不同时间点NR2B阳性细胞数与Ki67阳性细胞数有高度正相关性,r=0.968,P＜0.05.结论 （1）嗅球损伤能刺激成年大鼠SVZ神经干细胞的增殖;（2）嗅球损伤后NDMA受体亚单位NR2B表达增加,并且与神经干细胞的表达变化趋于一致,因此推断NR2B可能参与SVZ神经干细胞的增殖过程.     

NOV对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨NOV基因和蛋白对大鼠神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法：NOV基因重组质粒转染COS－7细胞和NSCs，收集COS－7细胞和NOV基因修饰COS－7细胞的条件培养液（简称COS－CM和NOV－CM），作用于培养的NSCs，^3H-TdR掺入检测NSCs的增殖，免疫细胞化学和流式细胞仪检测NSCs的分化。结果：①NOV－CM能明显促进NSCs对^3H-TdR的摄入，说明NOV－CM能明显促进细胞的增殖，另外NOV－CM的促细胞增殖作用具有一定的量效关系；②免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示，NOV－CM促进NSCs向神经元方向分化；③NOV基因修饰NSCs分化时，神经元的比例增高。结论：NOV可能具有促进NSCs增殖和分化的作用。     

神经生长因子对神经干细胞增殖的影响

目的:观察不同剂量神经生长因子(NGF)对体外培养的神经干细胞(NSCs)增殖的影响.方法:取人胚胎组织脑室区/脑室下区(VZ/SVZ)组织分离神经干细胞,培养于DMEM/F12 B27细胞基础培养液中,加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为阳性对照组;实验组培养液中分别加入NGF至终浓度的50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L;培养液无添加成分作为阴性对照组.用MTT比色分析法测定细胞增殖能力,倒置显微镜下观察细胞增殖情况.结果:3 d MTT比色显示,50μg/L NGF组细胞增殖较其他各组低(P＜0.05);培养10 d时细胞活力测定表明各组细胞均有一定程度的增殖,10μg/L NGF组与阳性对照组比较差异无统计学意义,与阴性对照组比较差异有统计学意义.结论:在一定浓度范围内NGF能明显促进神经干细胞的增殖.     

大鼠孕期染邻苯二甲酸二丁酯对子代神经干细胞增殖分化的影响

目的 探讨大鼠孕期染环境雌激素邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)对子代神经干细胞增殖和分化的影响.方法 40只SD孕鼠随机分为3个不同DBP剂量[25、75、225 mg/(kg·d)]的实验组和对照组,各组孕鼠自E0起分别给予不同剂量DBP或玉米油溶剂灌胃直至生产.取新生大鼠进行神经干细胞培养,检测计数细胞克隆形成率、克隆球直径大小;分离的神经干细胞进行分化培养,以Neu-N和GFAP免疫荧光检测DBP干预后的神经干细胞分化为神经元与星形胶质细胞的比例差别与形态变化.结果 大鼠孕期染DBP致子代神经干细胞增殖能力降低.与对照组相比,中、高剂量染毒组新生鼠神经干细胞克隆率明显低于对照组[实验对照组克隆率为(40.53±4.65)%;药物处理组克隆率分别为(30.96±3.80)%、(15.35±5.29)%、(6.58±1.43)%,P<0.01].高剂量处理组克隆球的直径也明显小于对照组.DBP高剂量组神经干细胞分化为星形胶质细胞比例显著增加[高剂量组为(36.8±3.5)%,而对照组为(30.8±2.4)%,P<0.01 ].分化后的神经元和神经胶质细胞形态随着染毒浓度增大,形态变化明显.星形胶质细胞的细胞突起逐渐变短,变粗,以高剂量染毒后为明显.结论 大鼠孕期染DBP会影响子代神经干细胞的增殖与分化,从而影响神经系统的发育.     

神经胶质细胞对神经干细胞增殖和分化影响的研究进展

神经干细胞具有自我更新和多项分化的潜能,在体内外不同的微环境下分化为神经元的比例和种类不同.神经胶质细胞广泛分布于中枢神经系统,为决定神经干细胞增殖、分化和存活的微环境起着至关重要的作用.近年来,研究发现嗅鞘细胞、雪旺细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经胶质细胞能促进神经干细胞的增殖和分化,并取得了一定的进展.     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法,探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞,并用EGF和血清诱导其分化,采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成,但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞,细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖,并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

Musashi1正调控肝细胞癌细胞的生长并促进其增殖

目的 Musashi1（MSI1）属于RNA结合蛋白（RBP）家族,可特异性地结合mRNA并对蛋白质的翻译起激活或抑制作用,但它在肝细胞癌（HCC）中的功能还未被深入探究。本课题主要探讨MSI1在HCC细胞生长及增殖中的作用及机制。方法 构建MSI1过表达或敲除细胞系。采用免疫组化和Western blot技术检测MSI1在HCC组织中的表达。采用MTT、流式等方法探讨过表达或沉默MSI1对HCC细胞增殖、细胞活力及细胞周期分布的影响,同时检测细胞内PCNA、Cyclin D1以及Wnt/β-catenin通路关键分子APC和β-catenin的表达。结果 MSI1在HCC组织中的表达比非肿瘤的癌旁组织高。与对照细胞相比,HepG2细胞过表达MSI1不仅显著促进了其生长（7 d时的MTT值从0.52±0.12大幅增加至1.01±0.14,P<0.01）,且处于G0/G1期的细胞比率也从（58.42±3.18）%降至（40.67±1.22）%,而S期细胞比率则从（28.51±1.93）%增加至（40.06±1.92）%（P<0.01）。与此同时,细胞PCNA和Cyclin D1蛋白的表达明显上调。反之,敲除MSI1使Huh7细胞的生长显著受抑,更多细胞停滞于G0/G1期（G0/G1期细胞比率从（43.83±1.57）%增加至（62.84±1.22）%（P<0.01）,同时细胞PCNA和Cyclin D1的表达则显著下调。MSI1的过表达可以降低Wnt/β-catenin信号通路分子APC但增加β-catenin的表达,反之MSI1的敲低却可以增加细胞内APC而降低β-catenin的表达。结论 MSI1可以通过正调控HCC细胞的生长及细胞周期的进程而加速HCC病程的进展,其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。     

体外共培养条件下毛囊神经嵴干细胞促进神经束膜细胞迁移和增殖

目的 探索体外培养神经束膜细胞的有效方案,并初步研究毛囊神经嵴干细胞(hfNCSC)对神经束膜细胞的激活作用.方法 采用"限时消化-差速贴壁-化学药物"方法对大鼠坐骨神经束膜细胞进行培养和纯化,同时培养大鼠触须垫hfNCSC,并对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定.借助Transwell小室建立hfNCSC与神经束膜细胞的共...     

Twist调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨增强或降低Twist表达对不同恶性程度的骨肉瘤细胞体外增殖、迁移、侵袭及体内成瘤的作用。方法Real-time PCR 及Western blot检测Twist在143B、MG63及TE85三种不同骨肉瘤中的基础表达。采用Ad-Twist及Ad-siTwist腺病毒感染 细胞,细胞生长曲线检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞的平行迁移能力,Transwell实验检测细胞的垂直迁移及侵袭能力。 Ad-Twist及Ad-siTwist感染Luc标记的143B细胞,制备胫骨近端骨肉瘤模型,活体成像动态观察细胞在体内的生长。结果在 骨肉瘤细胞中Twist 的基础表达显著高于C3H10 细胞（P<0.05）,其中在143B细胞表达最高,MG63 细胞次之,TE85 细胞中最 低,Twist的表达水平与骨肉瘤细胞的恶性程度呈正相关。Ad-Twist及Ad-siTwist感染细胞分别能显著提高或降低骨肉瘤细胞 中Twist的mRNA及蛋白水平的表达（P<0.05）。生长曲线结果显示Twist过表达能显著促进骨肉瘤细胞的增殖,而抑制Twist的 表达后,骨肉瘤细胞的增殖能力降低（P<0.05）。Transwell实验发现Twist过表达后,3种骨肉瘤细胞迁移或侵袭至小室的细胞 数明显增多,而抑制Twist的表达可降低骨肉瘤细胞的迁移侵袭能力（P<0.05）。143B细胞具有良好的体内成瘤能力,Twist过表 达促进143B细胞在裸鼠体内生长,活体成像动态观察荧光信号显著高于对照组,抑制Twist表达可显著抑制细胞在裸鼠体内生 长,信号明显弱于对照组。结论Twist可增强骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及体内成瘤能力。     

DCs和NSPCs共培养促进NSPCs增殖及其机制的初步研究

目的观察体外Transwell共培养系统中树突状细胞(dendritic cells,DCs)对神经干/前体细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)增殖的影响,初步探讨神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)在DCs调控NSPCs中的作用机制。方法根据是否采用Transwell小室将DCs和NSPCs共培养分为分隔培养(DCs/NSPCs组)和混合培养(DCs+NSPCs组),ELISA法测定DCs组、NSPCs组、DCs+NSPCs组、DCs/NSPCs组共培养48 h上清中的NT-3的含量。为观察NT-3在DCs调控NSPCs中的作用及可能的机制,成球法检测NSPCs组、NSPCs/DCs+K252a组、NSPCs+DCs组、NSPCs+NT-3组的NSPCs增殖,免疫细胞荧光法和Western blot法检测各组NSPCs表面酪氨酸激酶受体C(TrkC)的表达。结果 ELISA实验结果显示,Transwell共培养48 h上清NT-3的含量,NSPCs/DCs组较DCs组和NSPCs组明显升高(P<0.05)。镜下观察、测量结果显示NSPCs/DCs组和NSPCs+NT-3组神经球数量增多,平均直径明显增大(P<0.05)。免疫细胞荧光和Western blot检测结果表明,NSPCs+DCs组和NSPCs+NT-3组中NSPCs的TrkC表达较NSPCs组和NSPCs/DCs+K252a组高(P<0.05)。结论体外DCs与NSPCs共培养,促进NSPCs增殖、NT-3的分泌及TrkC的表达,NT-3可能是通过TrkC受体参与NSPCs增殖的调控。     

Dendritic cells promote neural stem/progenitor cells proliferation in vitro when cocultured

目的 观察体外Transwell共培养系统中树突状细胞(dendritic cells,DCs)对神经干/前体细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)增殖的影响,初步探讨神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)在DCs调控NSPCs中的作用机制.方法 根据是否采用Transwell小室将DCs和NSPCs共培养分为分隔培养(DCs/NSPCs组)和混合培养(DCs+ NSPCs组),ELISA法测定DCs组、NSPCs组、DCs+ NSPCs组、DCs/NSPCs组共培养48 h上清中的NT-3的含量.为观察NT-3在DCs调控NSPCs中的作用及可能的机制,成球法检测NSPCs组、NSPCs/DCs+ K252a组、NSPCs+ DCs组、NSPCs+ NT-3组的NSPCs增殖,免疫细胞荧光法和Western blot法检测各组NSPCs表面酪氨酸激酶受体C(TrkC)的表达.结果 ELISA实验结果显示,Transwell共培养48 h上清NT-3的含量,NSPCs/DCs组较DCs组和NSPCs组明显升高(P＜0.05).镜下观察、测量结果显示NSPCs/DCs组和NSPCs+ NT-3组神经球数量增多,平均直径明显增大(P＜0.05).免疫细胞荧光和Western blot检测结果表明,NSPCs+ DCs组和NSPCs+ NT-3组中NSPCs的TrkC表达较NSPCs组和NSPCs/DCs +K252a组高(P＜0.05).结论 体外DCs与NSPCs共培养,促进NSPCs增殖、NT-3的分泌及TrkC的表达,NT-3可能是通过TrkC受体参与NSPCs增殖的调控.     

成鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外分化为神经前体细胞的可能性.方法:MSC原代培养、传代后在细胞因子和氧化剂作用下进行诱导.形态学观察,免疫细胞化学、流式细胞分析和细胞电生理检查.结果:MSC体外可诱导为神经前体细胞,诱导后有表面抗原nestin表达,5 h分化率49.8%,同时具有早期神经干细胞电流特性.结论:骨髓来源的神经前体细胞治疗中枢神经系统疾病成为可能.     

小鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨小鼠神经干细胞的体外分离培养方法。方法 采用贴壁培养法,从成体小鼠大脑皮层分离并体外培养成体小鼠大脑皮层细胞,制成细胞悬液后将其置入DMEN/F12(1:1)液(包括15％FCS,bFGF20ng/ml,青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)培养,获得细胞克隆。应用免疫组织化学技术检测克隆细胞巢蛋白(Nestin)的表达。结果原代及传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成细胞克隆;克隆细胞表达巢蛋白(Nestin)。结论 分离的细胞在体外具有很强的增殖能力和自我更新能力,表达Nestin的为中枢神经系统的干细胞。     

EDS对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的观察在不同剂量蜕皮甾酮（ecdysterone,EDS）作用下,体外培养的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖、分化情况。方法原代培养新生SD大鼠海马NSCs,经EDS处理后,传代细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑盐比色法观察神经干细胞增殖能力的变化,免疫荧光细胞染色技术、流式细胞术检测神经干细胞分化情况。结果与对照组相比,中低剂量组（50、100、200mg／L）,对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的EDS（400mg／L及800mg／L）干预组则明显抑制了NSCs的增殖。在分化条件下,EDS200mg／L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,其余各组无统计学差异。结论EDS能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。     

丙泊酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及分化的影响

目的探讨丙泊酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法采用孕14～16 d Wistar大鼠,进行NSCs原代培养并用Nestin鉴定,按以下给药分成六组:空白对照组(control)、脂肪乳对照组(introlipid)、丙泊酚不同浓度组[5、25、50、100μmol/l],用5-溴脱氧尿(Brdu)掺入法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞增殖的影响。胚胎神经干细胞诱导分化过程中加入50μmol/l丙泊酚,采用NeuN、GFAP免疫组化法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞分化的影响。结果分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度丙泊酚组Brdu阳性细胞百分数没有差异,丙泊酚NeuN阳性细胞百分数(23.1±0.9%)明显高于对照组(13.4±0.8%)(P<0.05),而GFAP细胞阳性细胞数与对照组相比没有明显差异。结论临床相关剂量丙泊酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。