西方蜜蜂几丁质合成酶基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】本研究旨在明确西方蜜蜂Apis mellifera几丁质合成酶(chitin synthase, CHS)基因的分子特性，并揭示CHS在西方蜜蜂工蜂幼虫响应蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis胁迫的免疫应答中的功能。【方法】利用相关生物信息学软件预测和分析西方蜜蜂CHS蛋白的分子特性、保守基序和结构域。使用MEGA X软件对西方蜜蜂和其他昆虫CHSs的氨基酸序列进行系统进化分析。采用体外转录法合成CHS和egfp的dsRNA,饲喂蜜蜂球囊菌胁迫的西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫以进行RNAi,并利用RT-qPCR检测西方蜜蜂工蜂5日龄幼虫肠道中CHS及宿主响应蜜蜂球囊菌侵染的免疫相关基因abaecin,apidaecin,birc5,defensin-1和PGRP-S2的表达量。【结果】西方蜜蜂CHS蛋白含有1 572个氨基酸，属于20种氨基酸，其中正电荷氨基酸与负电荷氨基酸分别为177和169个，分子量约为178.77 kD,等电点为6.65;含纤维素合酶CESA3催化结构域。在西方蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana等共13种昆虫的CHSs中均鉴定到3个Motif (Motif 1,...     

环状RNA ame_circ_000115调节蜜蜂球囊菌胁迫下意大利蜜蜂幼虫肠道基因表达

环状RNA (circular RNA, circRNA)是一类新型非编码RNA,已被证实可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络等多种方式参与调节昆虫基因表达和免疫应答。目前,circRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)ame＿circ＿000115(简称ac115)的反向剪切(back splicing,BS)位点进行验证。采用RT-qPCR检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫下意蜂幼虫肠道内ac115的表达谱,利用双荧光素酶报告基因试验验证ac115与ame-miR-13b的结合关系。通过饲喂特异性siRNA对蜜蜂球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道内ac115进行干扰,进而检测干扰ac115对宿主免疫应答相关的6个基因表达量的影响。结果表明,ac115的BS位点真实存在;相较于未接种组,蜜蜂球囊菌接种组4日龄幼虫肠道内ac115的表达量极显著上调(P<0.000 1),5和6日龄幼虫肠道内ac115显著上调表达(P<0.05)...     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响

摘要: 【目的】吡虫啉(imidaclorprid)是广泛使用的新烟碱类杀虫剂之一。大量研究表明亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)幼虫的发育和成年蜜蜂的采集、学习等行为。本实验旨在探究亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂内勤蜂(1日龄成年工蜂)与外勤蜂(21日龄成年工蜂)免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响,进而为蜜蜂健康的维护提供科学依据。【方法】测定饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液不同时间后意蜂成年工蜂的存活率;利用荧光定量PCR检测饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液6 d后其体内免疫基因多酚氧化酶基因(PPOA3, GenBank登录号： GB43738), Abaecin类抗菌肽基因(ABA, GenBank登录号： GB18323),葡萄糖脱氢酶基因(GLD, GenBank登录号： GB43007)和解毒基因细胞色素P450基因(CYP450 6a2, GenBank登录号： GB49876)的表达,并采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定其体内细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)含量和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活力。【结果】1日龄和21日龄意蜂成年工蜂连续饲喂6 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,其存活率与对照组(饲喂含0.1 ng/μL丙酮的50%蔗糖溶液)无显著差异;连续饲喂9 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,1日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组无显著差异,而21日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组有显著差异。1日龄意蜂成年工蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液6 d后, PPOA3, CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平,细胞色素P450含量以及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势;而21日龄意蜂成年工蜂取食该药液6 d后,CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势,PPOA3表达水平和细胞色素P450含量有显著上调趋势。【结论】亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因的表达及免疫解毒酶系活力;吡虫啉短期胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活无显著影响,长期胁迫则会影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活。     

ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam对靶基因USP和P300的表达调控

【目的】本研究旨在通过饲喂法对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam进行过表达与敲减,明确ame-miR-bantam对靶基因USP和P300表达的调控作用。【方法】通过饲喂ame-miR-bantam模拟物(mimic-ame-miR-bantam)和抑制物(inhibitor-ame-miR-bantam)及相应的阴性对照mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam,对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道组织中的ame-miR-bantam分别进行过表达和敲减。利用生物信息学软件进行ame-miR-bantam的靶向预测及分析。通过RT-qPCR检测4-6日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的过表达和敲减效果及靶基因USP和P300的相对表达量。【结果】相较于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam,饲喂mimic-ame-miR-bantam后,ame-miR-bantam在意大利蜜蜂4-6日龄工蜂幼虫肠道中均显著上调;相较于饲喂inh...     

过表达和敲减ace-miR-3720对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的靶基因表达和重量的影响

【目的】本研究旨在明确ace-miR-3720在中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道发育中的功能,并为进一步探究ace-miR-3720调控肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ace-miR-3720的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-miR-3720和抑制物inhibitor-miR-3720,通过饲喂中华蜜蜂工蜂幼虫对ace-miR-3720分别进行过表达和敲减。采用RT-qPCR检测过表达和敲减ace-miR-3720后4-6日龄幼虫肠道内ace-miR-3720及其靶基因CKⅠ,MAPK1和βGBP1的相对表达量;使用分析天平称重过表达和敲减ace-miR-3720后的幼虫肠道重量。【结果】相较于无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组,mimic-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在中华蜜蜂4和5日龄幼虫肠道中均极显著上调,在6日龄幼虫肠道中显著上调;相较于无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组,inhibitor-miR-3720组中ace-miR-3...     

中华蜜蜂6日龄幼虫响应蜜蜂球囊菌侵染的长链非编码RNA应答研究

[目的] 本研究旨在探究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）6日龄幼虫应答蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）侵染过程中的差异表达谱及调控作用。[方法] 利用链特异性cDNA建库的RNA-seq技术对未被侵染及球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道（AcCK和AcT）进行深度测序。通过相关生物信息学软件分析lncRNA的结构特征和表达谱。筛选并分析差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）的顺式（cis）作用及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络。采用RT-qPCR验证测序数据及DElncRNA差异变化趋势的可靠性。[结果] AcCK和AcT共预测出642个已知lncRNA和487个新lncRNA。与蛋白编码基因相比,上述中蜂lncRNA外显子数更少、长度更短且表达量更低。43个antisense lncRNA与40个正义链mRNA之间互补配对。AcCK和AcT比较组包含367个上调lncRNA和268个下调lncRNA。有194个DElncRNA潜在调控461个上下游基因,并涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等38个功能条目以及氨基酸代谢、内吞作用和MAPK等191条通路。此外,有180个DElncRNA可靶向结合50个DEmiRNA,进而调控6365个mRNA;三者之间形成较为复杂的ceRNA调控网络。[结论] 中蜂6日龄幼虫肠道的部分lncRNA可作为antisense lncRNA参与应答球囊菌侵染;部分DElncRNA可通过cis作用调节物质代谢和免疫途径相关的上下游基因,从而介导宿主的侵染应答;TCONS_00010661和TCONS_00003104等DElncRNA可通过ceRNA网络调控Jak-STAT和氧化磷酸化等通路及富集基因,进而参与宿主的侵染应答。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂感染囊状幼虫病毒后免疫及发育相关基因表达比较

【目的】本文旨在探究囊状幼虫病毒(sacbrood virus, SBV)对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂幼虫发育和免疫基因、营养代谢基因、抗病毒基因、细胞发育及代谢相关基因表达的影响。【方法】从蜂群中移取2日龄的中蜂和意蜂幼虫,在培养箱(34℃, RH 85%)进行人工饲养,3日龄时接种SBV病毒,每天观察记录死亡情况,并通过实时定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测4日龄和7日龄幼虫体内SBV基因相对表达量,及免疫基因(Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin、Denfensin、Lys-1、Pgrp-lc、Kenny、Domeless)、营养代谢基因(Ilp1、Hex110、Vg)、抗病毒基因(Dis3、Dicer、Ago1)、细胞组成及发育调控基因(Vhdl、Co-1-iv)以及细胞代谢和调控基因(Mta1)的表达水平。【结果】通过分析比较发现,感染相同剂量...     

意大利蜜蜂幼虫肠道的miRNAs的生物信息学预测及分析

【目的】蜜蜂肠道是食物消化和营养吸收的主要部位,同时也是抵御病原侵染的重要场所。本研究旨在对意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称意蜂)幼虫肠道的microRNAs(miRNAs)及其靶基因进行深入分析,进而解析miRNAs在幼虫肠道发育和生长过程中的作用。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道进行测序,通过相关生物信息学软件对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测及分析。利用TargetFinder软件预测miRNAs的靶基因,然后将靶基因通过BLAST软件进行GO和KEGG数据库的功能注释。利用Cytoscape软件构建miRNAs与其靶向结合的mRNAs的调控网络。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序共获得96 329 456条有效标签序列(Clean tags),预测出560个miRNAs,包括45个novelmiRNAs。上述miRNAs的长度主要分布在17-27nt之间,且不同长度的miRNAs的首位碱基偏向性具有明显差异。表达量聚类分析结果显示,331个miRNAs为4、5和6日龄幼虫肠道所共有且表达量较为稳定,随着发育时间延长,特有miRNAs的表达水平呈总体增加的趋势。利用TargetFinder软件共预测出16479个意蜂幼虫肠道的靶基因,其中有8132和3361个可分别注释到GO和KEGG数据库,进一步分析发现有224个靶基因注释在Wnt信号通路,分别有2个和27个靶基因与保幼激素和蜕皮激素的调控密切相关。【结论】本研究在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测和分析,研究结果不仅丰富了意蜂的miRNAs信息,也为深入研究意蜂幼虫肠道的生长发育机理打下了初步基础。     

LncRNA13164通过ace-miR-4968-y调节中华蜜蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答

【目的】长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)等多种方式发挥重要的调控作用,但蜜蜂lncRNA的功能研究至今依然缺失,lncRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫响应蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染的免疫应答中lncRNA的调控功能及作用机制。笔者团队前期通过深度测序和生物信息学分析发现,lncRNA13164与ace-miR-4968存在靶向关系且潜在参与在中蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的应答。【方法】利用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测蜜蜂球囊菌接种后中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达谱。采用ILoc-Lnc RNA软件预测lncRNA13164的亚细胞定位。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测lnc...     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的nce-miR-23928及其靶基因表达谱

【背景】东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞而导致的微孢子虫病给养蜂业造成严重损失。【目的】检测东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-23928及其靶基因在侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为深入探究nce-miR-23928在东方蜜蜂微孢子虫侵染中的功能及调控机制提供依据。【方法】通过RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-23928的靶基因。使用BLAST工具将上述靶基因比对到基因本体论(geneontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)、Nr和Swiss-Prot数据库以获得相应注释。采用实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR,RT-qPCR)技术检测nce-miR-23928及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的相对表达量。【结果】相较于接种后1 d (1 day post infection, 1 dpi),nce-...     

球囊菌胁迫中华蜜蜂幼虫肠道过程中病原的转录组学研究

【目的】本研究利用RNA-seq技术对球囊菌胁迫的中华蜜蜂(中蜂)幼虫肠道进行深度测序,经趋势分析得到差异表达基因(DEGs)的显著表达模式,进而对胁迫过程中的球囊菌进行转录组学分析。【方法】利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序,并利用相关软件进行了深入分析。最后,通过RT-qPCR对RNA-seq数据进行了验证。【结果】本研究共得到球囊菌的41133932条高质量clean reads。22865个DEGs共聚类为8个基因表达模式,其中,16769个DEGs聚类为2个显著上调趋势与2个显著下调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于40与37个GO term,基因富集数最多的为细胞进程(2486 unigenes)。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于119和112个pathway,基因富集数最多的分别是氨基酸生物合成(127 unigenes)与核糖体(98 unigenes)。进一步分析表明球囊菌在胁迫中蜂幼虫肠道的过程中通过提高物质合成促进其增殖,而宿主通过抑制球囊菌的蛋白合成抵御病原入侵。富集在MAPK信号通路的11个DEGs的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐下降,推测中蜂幼虫通过抑制该通路而阻遏球囊菌增殖。【结论】本研究不仅为揭示白垩病过程中的球囊菌-中蜂幼虫互作提供了重要信息,也为阐明不同抗性蜂种的球囊菌抗性差异奠定了基础。     

Comparative susceptibility and immune responses of Asian and European honey bees to the American foulbrood pathogen,Paenibacillus larvae

American foulbrood (AFB) disease is caused by Paenibacillus larvae. Currently, this pathogen is widespread in the European honey bee— Apis mellifera. However, little is known about infectivity and pathogenicity of P. lan'ae in the Asiatic cavity-nesting honey bees, Apis cerana. Moreover, comparative knowledge of P. larvae infectivity and pathogenicity between both honey bee species is scarce. In this study, we examined susceptibility, larval mortality, survival rate and expression of genes encoding antimicrobial peptides (AMPs) including defensin, apidaecin, abaecin, and hymenoptaecin in A. mellifera and A. cerana when infected with P. larvae. Our results showed similar effects of P. larvae on the survival rate and patterns of AMP gene expression in both honey bee species when bee larvae are infected with spores at the median lethal concentration (LC5 0 ) for A. mellifera. All AMPs of infected bee larvae showed significant upregulation compared with noninfected bee larvae in both honey bee species. However, larvae of A. cerana were more susceptible than A. mellifera when the same larval ages and spore concentration of P. larvae were used. It also appears that A. cerana showed higher levels of AMP expression than A. mellifera. This research provides the first evidence of survival rate, LC50 and immune response profiles of Asian honey bees, A. cerana, when infected by P. larvae in comparison with the European honey bee, A. mellifera.     

侵染中华蜜蜂6日龄幼虫的蜜蜂球囊菌的微小RNA差异表达谱及调控网络

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis,简称球囊菌)是专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。MicroRNA(miRNA)作为一类重要的基因表达调控因子,能够广泛参与真菌及其宿主的相互作用过程。本研究通过比较分析球囊菌孢子(AaCK)和侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂) 6日龄幼虫肠道内的球囊菌(AaT)的smallRNA(sRNA)组学数据对球囊菌的差异表达miRNA(differentiallyexpressed miRNA,DEmiRNA)、靶mRNA及二者间的调控网络进行全面解析,旨在揭示miRNA介导的球囊菌对中蜂幼虫的侵染机制。【方法】对于球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道的small RNA-seq (sRNA-seq)数据,利用BLAST工具连续比对东方蜜蜂(Apiscerana)和球囊菌的参考基因组筛滤得到AaT的sRNA组学数据。分别将AaCK和AaT的sRNA组学数据比对miRBase数据库,对球囊菌侵染宿主前后miRNA的数量和结构特征进行分析。联用RNAhybrid+svm_light、Miranda和TargetScan软件预测AaCK vs AaT比较组中DEmiRNA的靶mRNA,进而利用相关生物信息学软件对上述靶mRNA进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析。通过Cytoscape软件对DEmiRNA-mRNA调控网络进行可视化。利用Stem-loop RT-PCR、RT-qPCR和分子克隆验证测序结果的可靠性。【结果】在AaCK和AaT中分别鉴定到380和387个miRNA。结构特征分析结果显示,AaCK和AaT的mi RNA皆集中分布在18–25 nt,且首位碱基主要偏向于U。AaCKvsAaT比较组共有270个DEmiRNA,包含155个上调miRNA和115个下调miRNA,分别靶向结合6091和6145个mRNA。GO分类结果显示,上述靶mRNA主要涉及代谢进程、细胞进程、应激反应等15个生物学进程;细胞、细胞组分、细胞器等12个细胞组分;催化活性、结合、转运子活性等11个分子功能。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述靶mRNA富集在123条代谢通路,参与对氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及核苷酸代谢等物质代谢,氧化磷酸化、硫代谢、氮代谢等能量代谢,以及MAPK和Hippo等信号通路的调控。球囊菌DEmiRNA与靶mRNA之间存在复杂的调控关系,其中miR-29-x、miR-250-x、miR-4968-y、miR-11200-x、novel-m0023-5p、novel-m0130-5p和novel-m0135-5p等DEmiRNA可靶向结合与球囊菌的半胱氨酸蛋白酶、DNA甲基化转移酶以及几丁质酶相关的mRNA;此外,miR-7-x、miR-9-z、miR-319-y和miR-5951-y等同时参与调控MAPK信号通路;进一步分析发现,miR-250-x同时参与对DNA甲基化转移酶、MAPK信号通路及其他酶类合成与代谢途径的调控,并可能参与球囊菌与中蜂6日龄幼虫之间的跨界调控。通过Stem-loopRT-PCR和RT-qPCR验证了4个DEmiRNA的差异表达,并利用分子克隆和Sanger测序证实miR-7-x的序列与测序结果一致。【结论】本研究解析了侵染中蜂6日龄幼虫的球囊菌的miRNA差异表达谱及DEmiRNA的调控网络,揭示了球囊菌DEmiRNA可能通过调控病原的物质和能量代谢、增殖、毒力、信号通路及相关mRNA参与对中蜂幼虫的侵染过程。miR-7-x、miR-250-x、novel-m0023-5p等关键DEmiRNA有望作为白垩病治疗的新型分子靶点。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的microRNA应答分析

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种能够侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,miRNA)可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程。本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA(DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,进而揭示DEmiRNA在中蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用。【方法】利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序,通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因。通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库。利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNA的调控网络。通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】本研究共预测出537个miRNA,其长度分布介于16–35 nt之间,且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显。通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达。AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA,包含31个上调和23个下调miRNA,可分别靶向结合6170和8199个靶基因。GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目,富集基因数最多的皆为结合细胞进程和催化活性。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway,富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工。调控网络分析结果表明,DEmiRNA及其靶mRNA形成十分复杂的调控关系;31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNA,18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNA;miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控。最后,随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证,结果证明了测序数据的可靠性。【结论】本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作。miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御,miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答。本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标。     

两种象甲幼虫肠道微生物组成及对高单宁食物的适应

【目的】象甲是栎属植物橡子中主要的寄生昆虫,但其适应高单宁食物(橡子)的肠道微生物基础尚待揭示。本研究分析了蒙古栎和辽东栎橡子中两种柞栎象(Curculio arakawai和C.dentipes)幼虫的肠道菌群结构和多样性,试图阐明柞栎象幼虫适应高单宁食物的肠道微生物基础。【方法】分别提取蒙古栎和辽东栎橡子中象甲幼虫各50头的肠道DNA,利用Illumina MiSeq技术对肠道菌群的V3–V4区序列进行16S rRNA测序,统计样品操作分类单元(OTU)数量,分析物种组成丰度、α多样性和β多样性。【结果】结果表明,可用于物种分类的OTU分别有2054和2308个,C. arakawai和C. dentipes共有的OUT 481个。在两种柞栎象C. arakawai和C. dentipes肠道菌群中,共注释到的主要分类阶元有27个门、145个科和274个属。变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)在两种象甲肠道菌群中占优势;假单胞菌属Pseudomonas(63.8%)、沙雷氏菌属Serratia(6%)和不动杆菌属Acinetobacter (5.2%)是C. arakawai肠道中的主要类群,而沙雷氏菌属Serratia (32%)、拉恩菌属Rahnella(24.2%)、气单胞菌属Aeromonas(6.8%)和立克次体属Rickettsia(6.6%)在C.dentipes肠道菌群中占主导优势。C. arakawai和C. dentipes肠道菌群α多样性无显著差异,β多样性则差异显著。具有单宁酶活性的肠道细菌,如粘质沙雷菌Serratia marcescens、乳球菌Lactococcus lactis、假单胞菌Pseudomonas spp.在C. arakawai和C. dentipes之间差异不显著。【结论】寄生在蒙古栎和辽东栎橡子中的C. arakawai和C.dentipes肠道菌群组成迥异,这可能与遗传因素和食物特点有关。具有单宁酶活性的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens和乳球菌Lactococcus lactis等菌类可能是两种象甲幼虫适应高单宁食物的肠道微生物基础。     

西方蜜蜂工蜂肠道菌群定殖起始点和定殖稳态点的结构比较分析

【目的】目前,针对昆虫肠道细菌定殖规律的研究还未见报道。探索西方蜜蜂(Apis mellifera)肠道菌群定殖过程两个重要时间节点(起始0日龄和稳态7日龄)间肠道细菌群落(菌群)结构组成的差异,加深对蜜蜂及昆虫肠道菌群定殖规律的认识。【方法】分别采集两个化蛹后工蜂发育阶段的个体各5只,分别解剖并提取其肠道菌群DNA。使用Illumina技术对肠道菌群16S rD NA高变区进行高通量测序。通过生物信息学的分析方法对肠道菌群进行多样性分析,并对两个时间点相对丰度最高的肠道菌群进行统计分析,比较肠道菌群相对丰度和组成的差异。【结果】共获得515156条高质量序列,长度为227904953bp,平均长度为442bp。基于OTUs的分类表明,工蜂肠道细菌分别隶属于34个门82个纲221个目405个科799个属。此外,工蜂肠道菌群定殖起点和终点间的Alpha多样性指数存在显著差异(ACE,P=0.0014;Chao,P=0.0013;Shannon,P=0.0003;Simpson,P=0.0028,Student’s t检验)。此外,相较0日龄工蜂,7日龄工蜂肠道中的乳酸杆菌Lactobacillus、Gilliamella、双歧杆菌Bifidobacterium、Snodgrassella4个属的相对丰度显著增加;相反,不动杆菌Acinetobacter、大肠杆菌志贺氏菌Escherichia-Shigella、鞘脂单胞菌Sphingomonas、类杆菌Bacteroides、涅斯捷连科氏菌Nesterenkonia、栖热菌Thermus6个属的细菌相对丰度显著降低(P0.05)。【结论】出房(0日龄)成年工蜂的肠道菌群多样性显著高于菌群定殖完成(7日龄)工蜂的肠道菌群多样性,且成年工蜂肠道菌群定殖完成前后部分类群的相对丰度显著改变。本研究的结果不仅可增加我们对蜜蜂肠道菌群定殖规律的认识,也能够为研究其他昆虫肠道菌群的定殖规律提供重要的参考信息。     

Hymenopteran specificity of Bacillus thuringiensis strain PS86Q3

The biological activity of Bacillus thuringiensis (Bt) strain PS86Q3 against five Hymenopteran species was determined by means of bioassays adapted to each species. Four species of sawfly that are important pests of conifers (Diprion pini, Gilpinia hercyniae and Pristiphora abietina) or ornamental plants (Arge rosae), as well as the non-target honeybee, Apis mellifera, were studied. Two out of the four sawfly species tested were found to be sensitive to PS86Q3 crystals or spore/crystal suspensions. A sporulated culture of this strain was moderately active on D. pini, and a complete bioassay with solubilized crystals was performed to estimate the LC₅₀ of 4.9 mg/ml. Pristiphora abietina was also found to be sensitive to PS86Q3, with an LC₅₀ of 1.6 mg/ml. By contrast, at the concentrations tested, PS86Q3 did not prove active on the remaining sawflies, G. hercyniae and A. rosae. The strain was administered orally to check its effects on honeybees which were fed sucrose solutions supplemented with a PS86Q3 sporulated suspension, in a field assay using commercial beehives. No significant differences in larval mortality (as deduced by comparing the number of larvae, pupae and empty cells) were found between the Bt and control treatments. On the basis of the results presented here, the suitability of PS86Q3 for the control of Hymenopteran pests, particularly sawflies, in terms of both potency and environmental safety, is discussed.