模拟缺血再灌注对乳兔窦房结细胞起搏电流的影响

目的观察模拟缺血再灌注（I／R）对乳兔窦房结细胞形态及起搏电流（If）的影响,阐明I／RN备窦房结细胞损伤的电生理特征改变。方法选用新生新西兰乳兔,采用双酶解法／差速贴壁法分离窦房结细胞,模拟I／R制备受损模型,利用膜片钳技术记录动作电位和风结果乳兔窦房结细胞主要呈梭形,搏动频率快,细胞表面光滑完整。模拟I／R后大部分细胞肿胀变形,伪足回缩,胞膜有较多颗粒、欠光滑。模拟再灌注后窦房结细胞If最大舒张电位由（-50．9±5．3）mV变为（-43．5±4．6）mV,电流密度由（-3．2±0．41）pA／pF变为（-2．47±0．32）pA／pF,其稳态激活曲线较对照组明显右移,半数激活电压由（-98．6±2．3）mV变为（-107．8±4．7）mV（P〈0．05）。结论模拟I／R导致窦房结细胞损伤,细胞电生理发生改变,尤以If重构为主。     

差速贴壁结合BrdU处理培养窦房结细胞

目的完全房室传导阻滞是心脏外科最严重的常见并发症,窦房结细胞移植是治疗思路之一,窦房结细胞的分离、培养难度很大,成功率低。本研究旨在建立一套可靠的窦房结细胞分离、纯化培养技术。方法新西兰乳兔的窦房结组织进行原代细胞培养,差速贴壁结合5-溴脱氧尿核苷（B rdU）处理。结果在培养的窦房结细胞中观察到3种不同形态的细胞,即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞。其中梭形细胞最多,且形态结构与电生理特征符合窦房结起搏细胞的特点,三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似。差速贴壁技术结合B rdU处理的纯化培养中窦房结细胞比例比常规方法高,分别为65%和45%（P<0.01）。结论用差速贴壁结合B rdU处理的纯化培养可显著提高窦房结梭形细胞的比例,是一种可靠的窦房结细胞培养技术。     

乳鼠窦房结细胞的原代培养与鉴定

目的 :建立一套可靠的窦房结细胞培养与鉴定技术。方法 :取Wistar乳鼠的窦房结组织 ,用差速贴壁技术及BrdU处理法进行原代细胞培养 ;对培养细胞进行形态学观察 ,用电生理技术记录细胞的动作电位。结果 :在培养的窦房结细胞中观察到有 3种不同形态的细胞 ,即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞 ,其中梭形细胞最多 ,且形态结构与电生理特征符合窦房结起搏细胞的特点。三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似。结论 :①用差速贴壁技术及BrdU处理法进行乳鼠的窦房结细胞培养 ,是一种可靠的窦房结细胞培养技术。②培养乳鼠窦房结细胞中的梭形细胞即为窦房结的起搏细胞     

乳鼠窦房结细胞的原代培养和形态学特征

目的比较差速贴壁技术和常规培养方法在体外获取窦房结自律细胞的密度,并观察其形态学特征。旨在建立可靠的窦房结自律细胞体外取材分离、纯化培养及形态学鉴定。方法取24 h内新生Wistar乳鼠1 20只,随机分为实验组(差速贴壁技术培养方法)和对照组(常规培养方法),每组60只。每次随机各取5只乳鼠行窦房结取材,分别用2种方法进行原代细胞纯化培养。通过光、电镜观察比较2种方法体外窦房结自律细胞的密度比及形态学特征。结果体外培养窦房结细胞有3种不同形态,梭形细胞、三角形细胞和不规则形细胞,其中梭形细胞最多,搏动频率最快;三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似;实验组窦房结梭形细胞比例明显高于对照组[(65±4)%vs(45±3)%,P<0.01]。结论采用差速贴壁技术纯化培养方法较常规培养可更明显提高窦房结梭形细胞的比例,是一种可靠的窦房结自律细胞培养、纯化技术。在培养的乳鼠窦房结细胞中,细胞体积小、搏动频率快的梭形细胞即是窦房结的起搏细胞。     

乳鼠窦房结细胞原代培养方法的优化

目的：对乳鼠窦房结细胞原代培养方法进行改进,并观察超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN4）在心脏细胞上的表达特点. 方法：取新生SD乳鼠的窦房结组织,在传统乳鼠窦房结细胞原代培养方法的基础上进行优化改进,选用0.1％胰蛋白酶与0.1％Ⅱ型胶原酶按照1∶1制成的混合消化酶,以减少窦房结自律细胞的损伤,混合酶消化后采用差速贴壁法及5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Brdu）纯化处理.通过免疫荧光实验观察HCN4在乳鼠心脏细胞上的表达情况. 结果：（1）本方法培养的心脏细胞存活率为95.8％.（2）经差逮贴壁、5-Brdu处理,窦房结细胞所占比例明显提高.（3）培养3～5 d,视野中绝大多数为搏动的心脏细胞,成纤维细胞无明显增殖,可观察到梭形、三角形和不规则形3种细胞.其中梭形细胞所占比例最高,其细胞器不发达,糖原颗粒不丰富,肌原纤维较少,搏动频率最快,表达HCN4;三角形细胞微量表达HCN4. 结论：（1）混合消化酶结合差速贴壁及5-Brdu处理,可以显著提高细胞成活率及窦房结梭形细胞的比例,是可靠的窦房结细胞的分离纯化方法.（2）搏动频率快、细胞器不发达、糖原颗粒少、HCN4表达阳性的梭形细胞可能就是窦房结的起搏细胞.     

乳鼠窦房结细胞取材与纯化培养方法的探讨

本研究旨在建立一套可靠的窦房结细胞取材分离、纯化培养技术。取Wistar乳鼠的窦房结组织进行原代细胞培养 ,随机分两组 :常规方法组与差速贴壁结合 5 溴脱氧尿核苷 (BrdU)处理组。结果 :①在培养的窦房结细胞中观察到三种不同形态的细胞 ,即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞。其中梭形细胞最多 ,且形态结构与电生理特征符合窦房结起搏细胞的特点。三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似。②常规方法培养中窦房结梭形细胞所占比例为 45 % ,而差速贴壁技术结合BrdU处理的纯化培养中梭形细胞达 6 8%左右 (P <0 .0 1)。结论 :用差速贴壁结合BrdU处理的纯化培养可明显提高窦房结梭形细胞的比例 ,是一种可靠的窦房结细胞培养技术     

乳兔单一左心房肌细胞原代培养及鉴定

目的探讨分离、纯化、培养并鉴定乳兔单一左心房肌细胞的实验方法。方法取出生48 h内乳兔左心房,用0.1%胰酶加0.1%Ⅱ型胶原酶混合消化,将消化的细胞经两次差速贴壁,再加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷抑制成纤维细胞生长进行纯化。计算酶消化后细胞存活率;倒置显微镜下观察左心房肌细胞贴壁生长状况、形态学变化等;绘制细胞生长曲线;鉴定左心房肌细胞纯度。结果消化后细胞存活率平均为85.2%;在倒置显微镜下观察,证实培养的左心房肌细胞能在较长时间内保持较高的活力;2~5 d为左心房肌细胞对数生长期,5 d后进入平顶期;左心房肌细胞经鉴定纯度达95%。结论采用混合酶消化法可以获得纯度高,在一定时间内具有较高活力的单一左心房肌细胞。     

大鼠乳鼠原代心房肌细胞培养的方法及鉴定

目的:介绍大鼠乳鼠心房肌细胞的分离、纯化,以及培养和鉴定方法. 方法:取1d龄SD大鼠心房组织,用0.1％胰蛋白酶和0.025％Ⅱ型胶原酶消化,将心房肌细胞收集在含10％胎牛血清的DMEM培养基中,用差速贴壁和5-溴脱氧尿嘧啶核苷纯化心房肌细胞.观察细胞形态,结合α-横纹肌肌动蛋白抗体免疫荧光鉴定心房肌细胞.结果:细胞培养24 h已完全贴壁,成梭形或三角形,无细胞搏动,细胞体积可逐渐增大.培养细胞经免疫荧光鉴定,95％为心房肌细胞 结论:该研究是一种较好的乳鼠心房肌细胞原代培养及鉴定方法.     

差速贴壁联合应用5-BrdU对心肌细胞纯度及活力的影响

目的研究多次差速贴壁并联合应用5-溴脱氧尿苷（5-B rdU）对分离的心肌细胞纯度及活性的影响。方法以酶消化法分离乳鼠心肌细胞,分别进行13次差速贴壁并联用或不联用5-B rdU以纯化心肌细胞。正常培养3 d后,观察细胞的形态特征。用流式细胞技术分析各实验组心肌细胞的纯度。以台盼蓝染色、MTT比色法及细胞线粒体内膜功能检测（流式细胞术）来反映各实验组心肌细胞的活性。结果随着差速贴壁次数的增加,心肌细胞得以纯化,但细胞的活性有所下降。联用5-B rdU后细胞纯度进一步提高,且对细胞的活性无明显影响;其中两次差速贴壁并联合应用5-B rdU后,可获得纯度高、活性好的心肌细胞。结论两次差速贴壁并联合应用5-B rdU为纯化心肌细胞的有效方法。     

替米沙坦对牵张刺激乳大鼠心房肌细胞短暂外向钾电流和动作电位的影响

目的探讨替米沙坦对牵张刺激乳大鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流（Ito）和动作电位（AP）的影响。方法利用胰酶与Ⅱ型胶原酶混合酶解,并结合差速贴壁和5-溴脱氧尿嘧啶核苷处理得到纯化的乳大鼠心房肌细胞。实验分对照组、牵张组、替米沙坦（1μmol/L）组。采用全细胞膜片钳技术分别记录三组Ito和AP。结果在＋20~＋60 mV刺激电压水平,Ito电流密度（pA/pF）：牵张组低于对照组[＋20 mV和＋60 mV分别为（0.8±0.3）vs（2.1±0.8）和（1.6±0.4）vs（12.1±3.0）;P均〈0.01],替米沙坦组[＋20 mV和＋60 mV分别为（1.4±0.3）和（6.7±1.3）较牵张组增大,P均〈0.01]。牵张组AP复极50%、90%时程（APD50、APD90）较对照组明显缩短[（9.6±1.3 ms）vs（15.5±2.4）ms,（29.9±2.9）ms vs（56.3±3.6）ms,P均〈0.01,n=9],替米沙坦组[APD50、APD90分别为（11.7±2.0）和（41.4±4.6）ms]较牵张组APD延长（P均〈0.05）。结论牵张刺激可降低乳大鼠心房肌细胞Ito电流密度、缩短APD;替米沙坦干预可抑制牵张刺激的此作用。     

乳鼠心肌细胞原代培养及电生理特征记录

目的分离培养原代乳鼠心室肌细胞,观察其搏动性,并探索其静息电位(RP)、自发性动作电位(AP)等电生理特征。方法用0.1%胰蛋白酶分离新生1～2 d SD大鼠心室肌细胞,并用差速贴壁法和5-溴脱氧尿嘧啶纯化心肌细胞;通过光镜观察心肌细胞形态和搏动情况;膜片钳技术记录心肌细胞的RP、自发性AP及钠离子电流(INa)特征。结果光镜下见培养12 h后心肌细胞基本贴壁,培养至第5 d时85%左右的心肌细胞都有自发性搏动,搏动频率80次/分左右;记录到自发性搏动心肌细胞RP为-85.34±4.15 mV,并可记录到同步产生的自发性AP,频率84±12次/分,而无自发搏动的心肌细胞RP为-42.1±6.5 mV,未能记录到自发性AP;心室肌细胞INa的阈电位为-60mV。结论该方法分离培养的原代乳鼠心室肌细胞搏动比例高,同时证实了自发搏动性是乳鼠原代心肌细胞状态佳,并具有良好电生理特征的重要标志。     

mHCN2基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞内向电流的记录及检测

目的构建超极化激活环的环核苷酸门控通道亚型2(mHCN2)基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs),采用膜片钳技术记录细胞的内向电流并检测其电生理特征。方法采用密度梯度离心法和贴壁分离法分离获得mMSCs。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pGH-mHCN2和pIRES2-EGFP,T4连接酶连接,构建质粒pIRES2-EGFP-mHCN2。脂质体将质粒转染至mMSCs,荧光显微镜下鉴定。全细胞膜片钳记录IHCN2并加入起搏电流特异性阻断剂Cs+检测其电流变化。结果酶切鉴定及测序检测证明质粒pIRES2-EGFP-mHCN2构建成功。荧光显微镜下可见转染成功的mMSCs发出绿色荧光。膜片钳记录到转染mHCN2基因的mMSCs的电压依赖性内向电流,其半最大激活电位为-95.1±0.9 mV,阈电位为-60 mV,最大激活电位为-140 mV。电极外液中加Cs+,内向电流几乎被完全抑制。未转染mHCN2的mMSCs未记录到内向电流。结论mHCN2基因在mMSCs中表达具有生理性起搏电流特征的电流,基因修饰的mMSCs有可能替代窦房结起搏细胞在自动除极过程中发挥重要作用。     

急性胰腺炎大鼠心室肌细胞瞬间外向钾电流的变化

目的探讨急性胰腺炎大鼠心室肌细胞瞬间外向钾电流的变化。方法以开腹胆总管注射牛磺胆酸钠的方法制备大白鼠急性胰腺炎实验模型，24～48h后处死动物分离单个心室肌细胞，采用全细胞膜片钳技术观察心肌细胞瞬间外向钾电流（Ito）的变化，以正常大白鼠心肌细胞的Ito为对照。结果急性胰腺炎大鼠心室肌细胞的瞬间外向钾电流受到抑制，电流密度电压关系曲线下移，其峰值电流密度由对照组的（52．16±13．12）pA／pF下降为急性胰腺炎组的（11．83±4．20）pA／pF，＋70mV的Ito电流密度较对照组下降了58．15％（P〈0．001），其失活曲线左移，半数最大失活电位对照组为（-45．2±8．3）mV，急性胰腺炎组为（-55．0±8．6）mV，与对照组比较显著减小（P〈0．001），失活速度加快；急性胰腺炎组Ito恢复速度明显减慢，恢复时程延长（与对照组比较P〈0．001）。结论急性胰腺炎后心室肌细胞的Ito受抑制，可能为急性胰腺炎后发生心律失常发生的机制之一。     

氟比洛芬酯对表达心脏SCN5A基因HEK293细胞钠电流的影响

目的:利用人胚肾293(HEK293)细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并观察氟比洛芬酯(flurbiprofen axetil,FA)对钠通道的影响。方法:野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于HEK293细胞,应用全细胞膜片钳记录使用FA(0.15μM)前后的钠电流。结果:转染效率约为70%,和使用FA前相比,用药后在每一指令电压上钠电流都减小;在测试电压为-40mV的条件下,钠电流峰值电流密度从(-159.74±63.80)pA/pF降至(-94.48±62.63)pA/pF(n=7,P=0.012);通道稳态激活半激活电压(V1/2)分别为(-51.66±7.69)mV和(-58.19±2.45)mV(n=7,P=0.048);稳态失活半激活电压(V1/2)分别为(-83.55±3.21)mV和(-85.25±4.78)mV(n=7,P=0.041);通道失活后恢复τ分别为(33.86±23.18)ms和(67.71±58.58)ms(n=7,P=0.048)。结论:FA可以减小各测试电压下的钠电流峰值(电压电流曲线向上漂移);加速通道的电压依赖性激活,促进通道的电压依赖性失活,失活后恢复变慢。     

卡维地洛对老龄大鼠心房肌细胞起搏电流的作用

目的研究卡维地洛（Car）对大鼠心房肌细胞起搏电流（If）的影响，探讨其降低心房颤动的机制。方法选择22～24月龄SD大鼠分离心房肌细胞，利用全细胞膜片钳技术记录If。结果Car可明显降低老龄大鼠心房肌细胞的超极化激活起搏电流，在-150mV时，1．0μmol／L Car使If的电流密度从（3．2±0．4）pA／pF降至（2．4±0．3）pA／pF（P％0．01）。Car的抑制电流效应呈电压依赖性，即随着超极化电位的增加，Car的效应也增加。在0．1～30．0μmol／L的范围内，Car以浓度依赖性方式阻滞起搏电流，其IC50为1．37μmol／L（95％可信限为1．96～0．57μmol／L）。进一步，Car可以使If的稳态激活曲线向超极化方向移动，使半激活电压从（-87．5±2．3）mV移至（-96．2±4．7）mV。从而使电流激活减慢，这可能是其减少，If的主要原因。结论卡维地洛可明显降低老龄大鼠心房肌细胞起搏电流密度。     

重组人脑钠肽对兔缺血再灌注后心室肌细胞L-钙离子通道电流的影响

目的研究重组人脑钠肽（rhBNP）对缺血再灌注后心室肌细胞L-钙通道电流（ICa-L）的影响,并探讨其细胞学离子机制。方法 45只新西兰大耳白兔随机分为缺血再灌注动物模型组（I-R组,n=15）、rhBNP治疗组（n=15）和假手术组（n=15）。采用酶解方法分离缺血部位心室肌外膜单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录ICa-L。结果①心律失常发生率：与I-R组比较,rhBNP组兔室速、室颤发生率及持续时间明显下降,而且其心律失常的评分也明显低于I-R组[（2.6±0.7）vs.（3.6±0.8）,P〈0.05];②电流密度峰值：I-R组、对照组、rhBNP组ICa-L电流密度峰值（0mV）逐渐升高,分别为（-4.34±0.92）pA/pF、（-3.42±0.76）pA/pF、（-3.13±1.22）pA/pF。结论 rhBNP可降低心肌缺血再灌注期间心律失常的发生率,心肌缺血再灌注后ICa-L明显增高,rhBNP可使ICa-L下调,逆转电重构。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的L型钙通道研究

目的：观察人骨髓间充质干细胞（hMSCs）诱导分化为心肌样细胞的电生理特征,L型钙离子通道的电流强度。方法：体外分离培养hMscs,以5－氮胞苷诱导分化为心肌样细胞。分别以体外分离培养的原代搏动的SD乳鼠心肌细胞（CMs）和同代次的hMSCs为阳性对照和阴性对照,利用膜片钳技术观察诱导分化为心肌样细胞的电生理特征L型钙离子通道的电流强度。结果：在20个心肌样细胞中,有6个细胞可记录到对硝苯地平敏感的内向钙电流,其最大内向峰值电流（ICa-Peak）在0mV为（112．60±8．26）pA;而hMSCs和乳鼠的CMs的ICa-Peak分别为（96．67±13．50）pA和（263．86±39．01）pA（n=6）,将诱导的心肌样细胞与未经诱导的hMSCs的ICa-Peak进行比较,P〈0．05具有统计学意义。结论：hMSCs经5-氮胞苷诱导后,其L型钙离子通道的钙电流增加,在电生理特性上具有向CMs分化的潜能。     

重组人脑钠尿肽对兔缺血/再灌注后心室肌细胞钠离子通道电流的影响

目的研究重组人脑钠尿肽（rhBNP）对兔在体缺血/再灌注（I/R）后心室肌细胞钠离子通道电流（INa）的影响,探讨rhBNP拮抗再灌注心律失常的细胞学离子机制。方法新西兰大耳白兔45只随机分为3组（n＝15）：I/R损伤组（I/R组,缺血30min后再灌注120min）;rhBNP治疗组[rhBNP组,再灌注后经动物耳缘静脉注射rhBNP 0.06μg/（kg·min）];假手术对照组（CON组,只开胸不结扎血管）。采用酶解的方法分离缺血部位心室肌外膜单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录INa。结果 CON组、I/R组、rhBNP组INa密度峰值（-30mV）分别为（-42.78±5.48,n＝16）,（-22.46±5.32, n＝12）,（-37.82±5.45,n＝15）pA/pF,I/R组较CON组明显下降（P＜0.01）,rhBNP组较I/R组明显升高（P＜0.01）。结论 I/R后心肌INa明显下降,给予rhBNP可使下降的INa上调,提示rhBNP可减轻或逆转这种电重构。