NF-κB信号通路介导AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9

目的： 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导人单核/巨噬细胞（THP-1细胞）基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的机制。方法: 用0.1 μmol/L佛波酯（PMA）作用48 h,诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞后,随机分为4组：（1）PMA组,即对照组;（2）PMA+AngⅡ组（10-7mol/L,1 h）;（3）PMA+AngⅡ+2-硫代氨基甲酸吡咯烷组［PDTC（10 μmol/L,30 min）］;（4）PDTC组。用Western blotting蛋白印记技术分别检测总蛋白MMP-9及磷酸化核转录因子-κB p65（NF-κB p65）的变化,用RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达的变化。结果: 与对照组相比,AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞磷酸化NF-κB p65增加（1.02±0.10,P<0.05）,MMP-9蛋白量也增加（1.06 ±0.11,P<0.05）,MMP-9 mRNA表达上调（1.22±0.08,P<0.05）,而使用NF-κB的抑制剂PDTC后磷酸化NF-κB p65（0.99±0.12,P<0.01）减少,MMP-9表达明显受到抑制（1.04±0.14, P<0.01）,MMP-9 mRNA表达下调（0.90±0.06, P<0.01）。结论: NF-κB信号转导途径是AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞表达MMP-9的重要途径之一。     

KLF6基因对THP-1细胞诱导分化的巨噬细胞凋亡的影响

目的:探讨过表达Kruppel样因子6(KLF6)基因对THP-1细胞诱导分化的巨噬细胞活力、凋亡、活性氧簇(ROS)水平及AKT信号通路的影响。方法:使用佛波酯(PMA)将人单核细胞株THP-1诱导分化为巨噬细胞,将巨噬细胞随机分为pcDNA3.1组、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)组、ox-LDL+pcDNA3.1组和ox-LDL+pcDNA3.1-KLF6组,其中pcDNA3.1转染参照Lipofectamine~(TM) 2000试剂盒说明。细胞处理24 h,通过MTT实验、Annexin V-FITC/PI双标细胞凋亡试剂盒和H_2DCF-DA探针分别检测细胞活力、凋亡率和ROS水平的变化;Western blot检测Bcl-2、Bax和p-AKT的蛋白水平。结果:pcDNA3.1-KLF6转染巨噬细胞后,KLF6表达明显升高(P0.05)。ox-LDL可明显抑制巨噬细胞的活力,诱导细胞凋亡,诱导细胞ROS的产生,上调Bax表达,下调Bcl-2和p-AKT的蛋白水平;而过表达KLF6可明显减弱ox-LDL对细胞活力、凋亡、ROS水平及Bcl-2、Bax和p-AKT蛋白水平的影响(P0.05)。结论:KLF6基因可明显降低ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,机制可能与降低细胞ROS水平及激活AKT信号通路有关。     

HBV X蛋白即时高表达上调巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的：将乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白真核表达载体pcDNA3.1（＋）-HBx转染巨噬细胞,观察X蛋白即时高表达对巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β的影响,为进一步研究HBVX蛋白的致病机制奠定实验基础。方法：将真核表达载体pcDNA3.1（＋）-HBx通过SuperFectTM脂转染试剂转染巨噬细胞24小时后,用LPS刺激巨噬细胞,利用Westernblot鉴定X蛋白在巨噬细胞中的表达,并用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测pcDNA3.1（＋）-HBx转染的巨噬细胞不同时间（12、24、48小时）培养上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β的含量,统计软件SPSS13.0分析所得数据。结果：将真核表达载体pcDNA3.1（＋）-HBx转染巨噬细胞,Westernblot结果显示pcDNA3.1（＋）-HBx能在巨噬细胞中表达约17kD的目的蛋白,即X蛋白;ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量,LPS刺激组及pcDNA3.1（＋）组与空白对照组有显著性差异（P〈0.01）,pcDNA3.1（＋）-HBx组与LPS刺激组及pcDNA3.1（＋）组有显著性差异（P〈0.01）,而LPS刺激组与pcDNA3.1（＋）组无显著性差异（P〉0.05）,即LPS可活化巨噬细胞分泌细胞因子,且X蛋白即时高表达可引起LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β明显增加。结论：乙型肝炎病毒X蛋白即时高表达上调LPS刺激的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。     

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.     

Toll样受体3信号通路在人类病毒性心肌炎心肌细胞凋亡及炎症反应中的作用

 目的：研究Toll样受体3（TLR3）信号转导通路与人类病毒性心肌炎（VMC）炎症反应及细胞凋亡的关系。方法：采用免疫组化 SP 法分别检测TLR3、干扰素β TIR结构域衔接蛋白（TRIF）、核因子 κB（NF-κB）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（caspase-3）在心肌组织中的变化, 原位末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡情况,比较VMC组及正常对照组组间的差异。结果：与对照组比较,VMC组心肌组织中TLR3、TRIF、NF-κB及caspase-3蛋白表达及细胞凋亡水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05), 并且TLR3和TRIF、TLR3和NF-κB、TRIF和NF-κB、NF-κB和caspase-3之间的表达均呈正相关,细胞凋亡指数的变化趋势与caspase-3一致。结论：通过TLR3信号通路介导的炎症反应和细胞凋亡在VMC发生、发展过程中起着重要作用,抑制其活化有可能成为治疗VMC的一个潜在的、有价值的靶位。     

HIV-1 Nef基因在THP-1细胞的表达和活性检测

目的将HIV-1 Nef基因转染THP-1细胞,获得稳定表达Nef蛋白的细胞克隆,为研究Nef对巨噬细胞生物学活性的影响奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+()阴性对照)转染THP-1细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、细胞免疫荧光等方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达及定位,采用共转染法将荧光报告基因转染THP-1Nef和THP-13.1细胞,通过测定荧光(RLU)值来评价Nef蛋白的生物学活性。结果转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的THP-1细胞株,RT-PCR及Western blot结果表明Nef在真核细胞中成功表达,细胞免疫荧光结果显示,THP-1-Nef细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。荧光酶标仪检测转染了HIV-1LTR-Luc和NFκB-Luc荧光报告基因的THP-1-Nef和THP-1-3.1细胞的RLU值。结论成功建立了THP-1-Nef细胞稳定表达细胞株,检测了其生物学活性,为进一步研究其作用机制实验奠定基础。     

A族链球菌表面新发现蛋白Fba真核表达质粒的构建及其诱导的免疫应答

目的：构建新发现的A族链球菌（GAS）表面蛋白Fba的真核表达质粒,并将其以及Fba蛋白、M蛋白分别免疫小鼠,对它们诱导的体液免疫及细胞免疫应答进行评价分析。探讨Fba蛋白作为GAS候选疫苗的可能性。方法：以SSI-9菌株（GASM1血清型标准株）作为模板,采用PCR方法扩增Fba基因,测序正确后克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建真核表达质粒pcDNA3.1/fba;将雌性CD1小鼠随机分成6组,分别为Fba蛋白免疫组、M蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba＋Fba蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba免疫组、pcDNA3.1空质粒对照及PBS对照组。ELISA检测各免疫组血清IgG的动态变化水平;脾细胞增殖试验检细胞增殖水平,并用流式细胞术检测小鼠体内CD4＋、CD8＋淋巴细胞的变化。试验结果经SPSS10.0统计处理。结果：成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/fba;质粒或蛋白免疫后小鼠IgG产生水平以Fba蛋白免疫组增高最为明显,其次为Fba质粒蛋白混合免疫组及Fba质粒组。特异性抗原诱导后体外脾细胞增殖试验显示：pcDNA3.1/fba免疫组增殖水平明显高于其它组,流式细胞检测结果与此一致,并显示以CD4＋T细胞水平升高为主,CD8＋T细胞水平在各组别之间也有一定的差异。结论：（1）Fba蛋白与M蛋白一样均能有效地诱导机体产生抗体,提示Fba蛋白很有希望成为GAS的候选疫苗。（2）成功构建了Fba蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/fba,且该重组质粒能有效地诱导抗链球菌所需的抗体,并能增强CD4＋T细胞、CD8＋T细胞的增殖功能。     

TLR-4信号转导通路介导层流切应力诱导血管内皮细胞IL-8基因表达的研究

目的: 观察TLR-4信号转导通路在层流低切应力诱导血管内皮细胞IL-8基因表达中的作用。方法: 设计突变引物, 用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增出胞内区段缺失突变TLR4 cDNA, 用PCR技术从其DNA中扩增出IL-8上游调控序列(IL-8USCS), 分别克隆于真核表达质粒pcDNA3及绿色荧光增强蛋白报告基因pEGFP1质粒,构建出重组TLR-4缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4和IL-8报告基因表达质粒pEGFP1-IL8USCS。用pEGFP1-IL8USCS转染或pcDNA3-mTLR4和pEGFP1-IL8USCS共转染ECV304细胞, 用4.2 dyne/cm²层流切应力刺激3 h, 流式细胞仪观察荧光蛋白表达强度变化。细胞裂解物IκB免疫印迹和NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色检测IκB的磷酸化及降解和NF-κB的活化。结果: 用pEGFP1-IL8USCS转染细胞, 经层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达增强(1.06:2.71), 同样用pcDNA3-mTLR4和pEGFP1-IL8USCS共转染细胞, 层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达未明显增强。细胞裂解物免疫印迹显示, 刺激10 min时磷酸化IκB即显著增强, 1 h后磷酸化IκB印迹强度几乎降到基线水平, 而IκB随刺激时间延长而逐渐降低, 1 h后几乎测不到IκB。NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示, 切应力刺激0.5 h, 胞核即出现阳性反应, 刺激1.5 h、2 h后, 胞核呈强阳性染色。结论: 本研究提示, TLR4/NF-κB信号转导通路可能介导层流切应力诱导血管内皮细胞IL-8基因的表达。     

β2GPI/aβ2GPI通过激活TLR4抑制THP-1巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白的摄取

目的探讨β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I抗体复合物(β2GPI/aβ2GPI)对巨噬细胞脂质摄取功能和B型清道夫受体CD36表达的影响,以及Toll样受体4(TLR4)在该过程中的作用。方法用100 ng/mL佛波酯(PMA)将THP-1人单核细胞诱导为THP-1巨噬细胞,通过形态学变化和1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳花菁高氯酸盐标记的氧化低密度脂蛋白(DiI-oxLDL)吞噬试验加以鉴定。用RPMI1640培养液、β2GPI、抗β2糖蛋白I抗体(aβ2GPI)和β2GPI/aβ2GPI处理THP-1巨噬细胞,实时荧光定量PCR和Western blot法检测TLR4 mRNA和蛋白水平。用RPMI1640培养液、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、oxLDL联合β2GPI/aβ2GPI和oxLDL联合LPS处理THP-1巨噬细胞,油红O染色观察胞内脂质积累,免疫荧光细胞化学染色法检测CD36的表达,实时荧光定量PCR检测CD36 mRNA水平,Western blot法检测CD36蛋白水平。利用TLR4阻断剂TAK-242(1μg/mL)预处理THP-1巨噬细胞,观察抑制TLR4对上述刺激下THP-1巨噬细胞脂质积累和CD36表达的影响。结果PMA处理后,THP-1细胞呈现巨噬细胞形态并具备脂质吞噬能力;与RPMI1640相比,β2GPI/aβ2GPI处理可显著增加THP-1巨噬细胞TLR4表达;与单独oxLDL处理相比,oxLDL联合β2GPI/aβ2GPI能够抑制THP-1巨噬细胞的脂质积累和CD36表达,阻断TLR4可以部分逆转这一现象。结论β2GPI/aβ2GPI能激活TLR4抑制巨噬细胞对oxLDL的摄取和CD36表达。     

分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin真核表达载体的构建及杀菌试验

目的构建分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin融合蛋白真核表达载体, 通过细胞感染模型研究其在胞内对结核分枝杆菌的杀伤效果。方法构建原核重组质粒pET32a-LysinB并诱导表达, 纯化蛋白后制备多克隆抗体;构建真核重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin并转染进单核巨噬细胞RAW264.7, 经制备的LysinB多克隆抗体进行表达鉴定后, 建立细胞感染模型并通过抗酸染色和菌落计数检测LysinB/Holin融合蛋白的杀菌效果。结果成功制备LysinB的多克隆抗体。重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin在真核细胞中有效表达LysinB/Holin融合蛋白且对细胞无明显毒性。LysinB/Holin融合蛋白可有效杀伤胞内的结核分枝杆菌。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin对胞内结核分枝杆菌有较好的杀伤效果, 且对细胞无明显毒性, 具有治疗结核病的潜能。     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）F基因，构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F，并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因，然后克隆到pGEM-3zf载体中，序列测定正确后，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），行酶切鉴定，脂质体法转染COS-7细胞，应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列，序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后，利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因，并在真核细胞中获得表达。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。 目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H₂O₂)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。 方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+ H₂O₂)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H₂O₂),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。 结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于?-淀粉样多肽的异常。  目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。 结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

过表达PGRN抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤

目的:探讨颗粒体蛋白前体(progranulin,PGRN)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺泡上皮A549细胞和HPAEpi C细胞增殖、凋亡及炎症的影响。方法:实验分为4组:对照(control)组为正常培养的细胞;LPS组用LPS(10 mg/L)处理;PGRN+LPS组在转染pc DNA3.1-PGRN质粒后加入LPS处理;pc DNA3.1+LPS组在转染pc DNA3.1-EGFP质粒后加入LPS处理。MTT试剂盒检测细胞活力;Brd U掺入实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-q PCR和Western blot分别检测PGRN的mRNA和蛋白表达;Western blot检测caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65和p-IκB-α的蛋白水平。结果:与对照组相比,LPS组的细胞增殖率下降(P0.05),凋亡率上升(P0.05),caspase-3和Bax的蛋白表达上调(P0.05),Bcl-2的蛋白表达下调(P0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达上调(P0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平增加(P0.05),与LPS组相比,PGRN+LPS组的细胞增殖率上升(P0.05),凋亡率下降(P0.05),caspase-3和Bax的蛋白表达下调(P0.05),Bcl-2的蛋白表达上调(P0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达下调(P0.05),p65和p-IκB-α的蛋白水平降低(P0.05)。结论:PGRN过表达可以减轻LPS诱导的A549细胞和HPAEpi C细胞增殖、凋亡异常及炎症因子产生等损伤,这可能与PGRN参与调控NF-κB信号通路有关。     

KLF4对结直肠癌细胞生长抑制及化疗敏感性的影响

目的:探讨Krüppel样因子4(KLF4)对结直肠癌细胞活力、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响。方法:Western blot法检测KLF4在结直肠癌Caco2、SW480和HCT116细胞中的表达。将SW480细胞分为pc DNA3. 1组(转染pc DNA3. 1空质粒)、pc DNA3. 1-KLF4组(转染构建的pc DNA3. 1-KLF4过表达质粒)和pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组(转染pc DNA3. 1-KLF4 48 h后用1 mg/L顺铂处理细胞48 h),Western blot检测KLF4、p-IκBα、细胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)的蛋白水平; CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率; DCFH-DA探针检测活性氧簇(ROS)含量。结果:KLF4在结直肠癌细胞中的表达均显著低于在人结肠黏膜上皮NCM460细胞的表达(P 0. 05)。与pc DNA3. 1组相比,pc DNA3. 1-KLF4组的KLF4蛋白表达显著增高(P 0. 05),细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著增高;而pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著低于pc DNA3. 1-KLF4组,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著高于pc DNA3. 1-KLF4组(P 0. 05)。结论:上调结直肠癌细胞KLF4基因表达可降低肿瘤细胞活力,诱导细胞凋亡,增强顺铂化疗敏感性,其机制可能与提高细胞内ROS含量及下调NF-κB信号关键分子IκBα的磷酸化水平有关。     

青蒿素减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤的实验研究

目的:探究青蒿素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肠上皮IEC-6细胞屏障功能损伤的影响。方法:体外培养IEC-6细胞,随机分为5组:对照组、LPS(100 mg/L)组和LPS+青蒿素(30、50和100μmol/L)组,MTT法检测各组细胞毒性变化,ELISA检测各组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的变化,电阻仪检测肠上皮细胞跨上皮电阻(TER),酶标仪检测单层细胞对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-1和occludin)以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达的变化。结果:LPS与青蒿素在本实验浓度范围对IEC-6细胞均无毒性。与对照组相比,LPS处理下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB的mRNA和蛋白表达明显增加,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达降低。而青蒿素干预下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达明显降低,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达升高(P0.05),均呈现浓度依赖性。结论:青蒿素可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB通路减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤。