T淋巴细胞体外发育方法的研究进展

T淋巴细胞（简称T细胞）在细胞过继免疫治疗（ACT）中发挥重要作用,利用T细胞体外发育方法可获得来源稳定且获取简便的T细胞,相比从自体或同种异体组织分离得到T细胞的传统方法更有优势。目前T细胞体外发育方法有胎儿胸腺器官培养、重组胸腺器官培养和Notch信号驱动的二维培养三种。其中胎儿胸腺器官培养操作简便,离体胸腺在体外培养即可支持T细胞分化发育至成熟,但完整的胸腺导致培养物维持时间有限、细胞收获困难;重组胸腺器官培养将各类胸腺基质细胞分散再重组构建三维培养环境,在体内外实验中均可支持T细胞成熟,但生物材料和三维环境导致培养物维持时间和细胞产量均受限;Notch信号驱动的二维培养采用人工呈递Notch信号通路配体来驱动T细胞分化发育,培养体系结构简单且稳定,但仅能支持T细胞发育至早期未成熟阶段。本文综述了上述培养方法的研究进展和不足之处,并讨论了T细胞体外发育未来发展的要求和方向,以助力ACT的推广和应用。     

人脐血CD56+细胞毒性淋巴细胞的扩增研究

目的:从人脐血单个核细胞(CBMC)中高效扩增CD56+细胞毒性淋巴细胞.方法:以干细胞生长培养基(SCGM)为基础培养基,设计不同浓度抗CD3单抗、IL-2的培养条件,从CBMC中诱导扩增CD56+细胞毒性淋巴细胞,用四甲基氮唑蓝(MTI)法检测其对肿瘤细胞株K562和Raji的杀伤活性,并与抗CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3AK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)进行比较.结果:在以SCGM为基础培养基时,CBMC经500ng/ml抗CD3单抗、500U/ml IL-2作用获得大量增殖,在12天时扩增(14.7±4.0)倍,(56.4±2.8)％为CD56+细胞,其中CD3-CD56+NK细胞和CD3+CD56+T细胞分别占细胞总数的(24.9±5.3)％和(30.0±4.7)％:在效/靶比10:1时,对K562和Raii的杀伤率分别为80.5％和55.3％,均显著高于CD3AK和CIK细胞.结论:在抗CD3单抗和IL-2作用下可使用SCGM,获得以CD56+淋巴细胞为主的强细胞毒性免疫效应细胞,为进行肿瘤过继免疫治疗提供了一种简单的扩增脐血CD56+细胞毒性淋巴细胞的方法.     

人脐血CD56^＋胞毒性淋巴细胞的扩增研究

目的从人脐血单个核细胞(CBMC)中高效扩增CD56+细胞毒性淋巴细胞.方法以干细胞生长培养基(SCGM)为基础培养基,设计不同浓度抗CD3单抗、IL-2的培养条件,从CBMC中诱导扩增CD56+细胞毒性淋巴细胞,用四甲基氮唑蓝(MTI)法检测其对肿瘤细胞株K562和Raji的杀伤活性,并与抗CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3AK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)进行比较.结果在以SCGM为基础培养基时,CBMC经500ng/ml抗CD3单抗、500U/ml IL-2作用获得大量增殖,在12天时扩增(14.7±4.0)倍,(56.4±2.8)%为CD56+细胞,其中CD3-CD56+NK细胞和CD3+CD56+T细胞分别占细胞总数的(24.9±5.3)%和(30.0±4.7)%在效/靶比101时,对K562和Raii的杀伤率分别为80.5%和55.3%,均显著高于CD3AK和CIK细胞.结论在抗CD3单抗和IL-2作用下可使用SCGM,获得以CD56+淋巴细胞为主的强细胞毒性免疫效应细胞,为进行肿瘤过继免疫治疗提供了一种简单的扩增脐血CD56+细胞毒性淋巴细胞的方法.     

恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞体外扩增后亚群的变化

目的:观察23例恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞在体外经扩增培养后总CD3 、CD3 CD4 、CD3 CD8 淋巴细胞及CD3-CD16 56 (NK细胞)、CD3 CD16 56 (NKT细胞)的变化,初步观察淋巴细胞体外扩增培养后回输患者的生物安全性。方法:体外大规模诱导和扩增恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞及单个核细胞,然后应用流式细胞术测定扩增前后CD3 、CD3 CD4 、CD3 CD8 、CD3-CD16 56 、CD3 CD16 56 细胞在淋巴细胞中所占百分比的变化。结果:CD3 、CD3 CD8 、CD3 CD16 56 细胞比例较培养前明显增加(P<0.01),而CD3 CD4 和CD3-CD16 56 细胞比例则明显的降低(P<0.01)。所有患者细胞回输治疗后无明显的毒副反应。结论:在本研究体系下体外诱导扩增培养肿瘤患者自体外周血NK细胞及致敏淋巴细胞效率较高,细胞毒性细胞比例增高较大,具有良好的生物安全性。     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞的体外扩增培养

目的 :探讨慢性髓性白血病 (CML)来源的树突状细胞 (DC)的体外扩增及其功能 .方法 :采用两步法 ,首先将慢性髓性白血病骨髓或外周血CD34+ 细胞与rhFlt3 L和rhTPO共育 7d,再用rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4诱导培养1 4d ;同时以rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4直接诱导体系作对照 .获得的DC通过免疫表型检测、电镜分析及染色体鉴定 ,并用MTT法检测其刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细胞的杀伤作用 .结果 :两步法培养 2 1d ,CML的CD34+ 细胞扩增 (76 . 5 6± 5 . 1 7)倍 ,DC产率 (39. 1 0± 8. 0 3) % ,直接诱导产生DC扩增倍数及比例均低于两步法 (P <0 . 0 1 ) ,且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖进而杀伤CML细胞 .结论 :两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率 ,优于直接诱导培养 ;CML细胞来源的DC可诱导抗白血病免疫应答的产生     

特异性体外扩增人γδT淋巴细胞及其生物学特性的研究

探讨人γδＴ淋巴细胞体外特异性激发的方法，及其杀伤肿瘤细胞的分子机理。方法采用人多发性骨髓瘤细胞株ＸＧ－７细胞作为刺激细胞，与人外周血单个核细胞体外共同培养，激发和扩增人γδＴ淋巴细胞。以流式细胞仪或间接免疫荧光技术分析细胞表型；再以５１Ｃｒ４小时释放试验检测γδＴ淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。结果（１）采用本培养系统，可以使来自健康人或肿瘤患者的外周血γδＴ淋巴细胞得以选择性激发和扩增，由４．８％±３．４％增加至４６．０％±８．３％，在白细胞介素２（ＩＬ－２）的作用下，能迅速、大量地增殖，３周内可达１０１０以上数量级。（２）所扩增的γδＴ淋巴细胞，对肿瘤细胞株（天然杀伤细胞敏感株Ｋ５６２和淋巴因子激活的杀伤细胞敏感株Ｄａｕｄｉ）皆可介导高效杀伤活性，而对正常淋巴母细胞则无明显细胞毒作用。（３）抗热休克蛋白（ＨＳＰ）－７０单克隆抗体可阻断γδＴ淋巴细胞对ＸＧ－７细胞的反应。结论本室建立的人γδＴ淋巴细胞体外激发、扩增的方法，具有简便、迅速、重复性好的特点，对肿瘤细胞具有广谱的细胞毒活性，在肿瘤的过继免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。     

WT1基因肽诱导细胞毒性T淋巴细胞免疫治疗白血病的实验研究

目的探讨肾母细胞瘤基因(WT1)肽负载树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对白血病细胞体外靶向免疫治疗作用。方法合成一段针对HLA-A0201锚位的WT1特异性九聚肽(CMTWNQMNL),体外负载来源于HLA-A0201阳性健康志愿者的DC后,诱导产生WT1肽特异性、HLA-A0201限制的CTL(A组),四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法观察其对白血病细胞株及原代白血病细胞体外杀伤效应。采用流式细胞术直接免疫荧光标记法,检测DC表面抗原CD83、CD1α、CD80、CD86、CD14、HLA-DR和T细胞表面的CD3、CD4、CD8、CD56等的表达。设立单独DC诱导CTL(B组)和IL-2诱导T细胞(C组)作为对照组。结果K562细胞不表达HLA-A0201但高表达WT1基因(1.111±0.128);U937细胞表达HLA-A0201,但极低表达WT1基因(0.006±0.001);NB4细胞表达HLA-A0201,且高表达WT1基因,NB4/WT1D、NB4/WT1A及NB4细胞株中WT1表达水平分别为1.42±0.07、3.20±0.19和1.14±0.09,均显著高于U937细胞株(P均<0.01)。A组CTL能够通过HLA-A0201限制方式杀伤HLA-A0201阳性,WT1+NB4白血病细胞株和白血病患者原代骨髓单个核细胞,而不能特异性杀伤HLA-A0201阳性,WT1-U937细胞胞株及白血病细胞,HLA-A0201-,WT1+K562细胞株及白血病细胞,对HLA-A0201阳性或阴性正常骨髓细胞也无杀伤活性;A组CTL对NB4/WT1D、NB4/WT1A和NB4细胞株杀伤活性无统计学意义(P=0·065,P=0·621)。结论WT1肽特异性CTL能够以HLA-Ⅰ类抗原限制方式杀伤高表达WT1基因的白血病细胞,而对正常骨髓细胞无杀伤作用,WT1基因的表达产物可以作为白血病免疫治疗靶点。     

体外高效扩增人外周血调节性T细胞技术的建立

目的：建立一种调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）体外高效扩增技术。方法：流式细胞仪分选健康人外周血CD4+CD25+CD127low T细胞,CD3/CD28磁珠刺激联合高浓度白介素?2（interleukin 2,IL?2）培养14 d。通过细胞计数评估Tregs体外扩增能力,采用流式细胞仪鉴定扩增Tregs的表型,采用混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）实验检测Tregs的抑制功能。结果：CD4+CD25+CD127low T细胞培养14 d后增殖（755.5 ± 213.5）倍。流式细胞鉴定扩增后的细胞：CD4分子表达为（98.3 ± 1.04）%,CD19分子表达为（0.039 ± 0.021）%,CD8分子表达为（0.443 ± 0.239）%,CD25分子表达为（97.6 ± 1.35）%。FOXP3分子表达为（87.7 ± 5.5）%,Helios分子表达为（73.3 ± 2.9）%。MLR实验显示：Tregs以不同比例与外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）共培养,当Tregs∶PBMC为1∶1时,PBMC增殖抑制率最高,为（84.39 ± 1.98）%。结论：成功建立一种体外高效扩增Tregs技术。扩增后细胞保留原有的细胞表型,并具备免疫抑制功能,为临床运用Tregs治疗自身免疫性疾病、抑制移植排斥反应提供了广阔的应用前景。     

NK、T混合淋巴细胞抑制肿瘤细胞的体外研究

目的:探讨人外周血淋巴细胞诱导扩增的NK、T混合淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤特性。方法:MTT法测定培养后NK、T混合淋巴细胞对PLA-801D、A549、LS-174 t及MDA-MB-231肿瘤细胞系的抑制率,对PLA-801D进行不同效靶比及不同作用时间抑制率的测定。结果:NK、T混合淋巴细胞对4种肿瘤细胞系均有明显抑制作用,且不同细胞系间抑制率具有显著差异(P<0.05)。结论:NK、T混合淋巴细胞对多种肿瘤细胞系具有强大的抑制作用,对PLA-801D抑制率与效靶比成正比,作用4 h有最大抑制率。     

细胞毒性T淋巴细胞活性的检测及应用

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的测定是了解机体细胞免疫功能的重要方法,在表位鉴定、疫苗效果评价、预测移植排斥反应等研究中广泛应用,因此有效地检测其功能非常重要,本文综合叙述了主流的检测方法及其各自应用。     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

丹参注射液对肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增及抗肿瘤作用

目的观察丹参注射液对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增及抗肿瘤免疫作用,为扩大该药的临床应用范围提供依据.方法从癌症患者恶性胸水中分离获取TIL和自体瘤细胞,观察丹参注射液对TIL体外长期存活、扩增及抗肿瘤作用的影响.结果(1)丹参注射液可使TIL体外长期存活(>17d).(2)丹参注射液可使TIL在10d内持续扩增并在11～15d保持较高水平.TIL在完全培养剂内则在1周内死亡.(3)扩增后的TIL在体内外的抗肿瘤活性均明显增强,作用类似IL2.结论丹参注射液可明显促进TIL的体外扩增及抗肿瘤作用,可作为TIL的中药促进剂来替代IL2.     

IFN-γ增强人γδT细胞杀伤骨肉瘤细胞的研究

目的研究干扰素-γ（IFN-γ）增强骨肉瘤患者γδ T细胞对骨肉瘤杀伤作用的影响。方法以唑来磷酸法扩增骨肉瘤患者外
周血γδ T细胞。分别使用实时荧光定量聚合酶链反应和流式细胞术检测IFN-γ处理前后骨肉瘤细胞Fas的表达情况;LDH法检
测骨肉瘤患者γδ T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤活性。结果IFN-γ对骨肉瘤细胞Fas的表达明显提高（P<0.01）,骨肉瘤患者γδ T细
胞对骨肉瘤细胞的杀伤作用显著增强（P<0.01）。抗人FasL抗体对γδ T细胞杀伤OS细胞作用影响较小（P>0.05）;但能显著阻断
γδ T细胞杀伤IFN-γ预处理OS细胞的作用,差异均有统计学意义（P<0.01）。结论IFN-γ可增强骨肉瘤患者γδ T细胞的抗骨肉
瘤作用。
     

靶向阻断转化生长因子-β信号通路对肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的影响

目的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)是体内杀伤肿瘤的最终效应细胞,但其免疫功能会被肿瘤分泌的转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)所抑制,文中观察靶向阻断TGF-β信号通路对肿瘤特异性CTL的影响。方法利用包涵修饰过的TGF-βⅡ型受体(transforming growth factorβreceptor typeⅡ,TβRⅡ)质粒的逆转录病毒载体,转染经DC激活的小鼠肾癌Renca细胞敏感的CTL(tumor pulsed CTL,TP-CTL),获得对TGF-β不敏感而肿瘤特异性的CTL(TβRⅡDN-CTL),Western blot检测Smad-2的磷酸化情况,观察TGF-β对CTL体外增殖抑制情况,将TβRⅡDN-CTL与未阻断TGF-β信号通路TP-CTL分别与相关及无关肿瘤细胞共同孵育,应用51Cr释放实验测定其细胞毒作用,将已成瘤的动物模型分为TP-CTL组和TβRⅡDN-CTL组分别尾静脉过继性注射TP-CTL及TβRⅡDN-CTL,ELISA法检测小鼠体内IL-2和IFN-γ水平。结果 TβRⅡDN-CTL组对TGF-β增殖抑制率明显低于TP-CTL组(65.96%vs 2.08%,P<0.01);在效靶比为100∶1时,TβRⅡDN-CTL组较TP-CTL组显著提高免疫小鼠CTL的特异性杀伤作用[(50.40±4.48)%vs(17.70±1.42)%,P<0.01],而动物模型血浆中TβRⅡDN-CTL组较TP-CTL组的IL-2、IFN-γ水平也显著升高(P<0.01)。结论阻断肿瘤敏感的CTL的TGF-β信号通路可以克服肿瘤的免疫抑制作用,提高CTL对肿瘤的杀伤效率。     

细胞毒性T淋巴细胞在乙型肝炎中的作用研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)感染后，决定病情严重程度及病程转归的一个主要因素是机体的免疫反应能力。由于患者体内抗病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在清除病毒方面发挥重要的功能，下面就CTL在乙型肝炎中作用研究近况综述如下。     

EBV特异性细胞毒淋巴细胞的体外诱导和对鼻咽癌细胞的杀伤活性

目的 探索体外诱导和扩增EBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的方法,探讨其应用于鼻咽癌(NPC)治疗的可能性.方法 用EB病毒转化的B淋巴细胞系为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经照射灭活后刺激自体外周血单个核细胞(PBMC),产生EBV特异性CTL,以抗人CD3抗体OKT-3/同种异体PBMC法扩增.并检测其对NPC细胞的特异性杀伤.结果 在体外有效诱导和扩增了EBV特异性的CTL.扩增前CTL对自体BLCL的杀伤率为76%,对同种异体BLCL的杀伤率为13%,对自体肿瘤细胞的杀伤率为51%,对CNE鼻咽癌细胞的杀伤率为27%.扩增后的杀伤率分别为63%、25%、49%、33%.扩增后CTL对肿瘤杀伤力没有明显下降.结论 EBV特异性CTL能在体外有效地诱导,对NPC细胞有特异性的杀伤力,能在体外大量地扩增,且扩增后对肿瘤的杀伤力没有明显下降,有望成为NPC患者有效的过继免疫治疗方法.     

香菇多糖对肿瘤浸润淋巴细胞体外扩增及抗瘤活性的影响

香菇多糖 (Ｌｅｎｔｉｎａｎ)是从香菇子实体中提取的抗肿瘤性多糖体。实验证明香菇多糖对人淋巴细胞ＩＬ -2分泌及ＩＬ -2Ｒ表达具有一定的调节作用 ;可促进Ｔ细胞、ＮＫ细胞及ＬＡＫ细胞的产生[1,2 ] 。本实验观察了香菇多糖对肺癌肿瘤浸润淋巴细胞 (ＴＩＬ)体外扩增及抗瘤活性的影响。1　材料和方法1 1　材料 　 2 2例肺癌患者 ,男 1 5例 ,女 7例 ,年龄为 4 0～ 63岁 ,平均年龄 52 5岁 ,其中鳞癌 1 2例 ,腺癌1 2例 ,所有病例均经手术病理确诊。手术切除的肿瘤组织以无菌操作收集于含抗生素的培养液中 ,待分离ＴＩＬ和肿瘤细胞。1 2　…     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因－ｎｅｏ基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５－Ｓ细胞，斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５－Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５－Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５－Ｓ细胞要作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠Ｈ     

砷在体外对人T淋巴细胞和Jurkat T细胞系的生长抑制作用

目的:通过三氧化二砷在体外对人 T淋巴细胞生长的影响 ,探讨三氧化二砷的免疫毒性和免疫抑制作用的机制。 方法 :应用正常人外周血 T细胞和人 Jurkat T细胞作为体外实验模型 ,观察不同浓度 (0 .5～ 10 0μM)三氧化二砷对正常人淋巴细胞和人 Jurkat T细胞的生长影响 ,并用电镜观察三氧化二砷对人 Jurkat T细胞的形态学改变。结果 :体外实验结果显示 ,三氧化二砷在 0 .5～ 10 0 μM浓度范围对正常人 T细胞和人 Jurkat T细胞的生长有明显的抑制作用 ,并随着三氧化二砷的浓度增高而抑制作用增强 ,呈现为剂量 -反应关系。三氧化二砷对正常人 T淋巴细胞和人 Jurkat T细胞的 IC50 分别为 8.0 5 μM和 8.9μM。电镜观察结果提示 ,三氧化二砷 (5 μM,2 4 h)处理 Jurkat T细胞 ,导致较多细胞出现细胞体积缩小 ,细胞核内染色质浓集于核膜内面成团块状 ,或染色体断裂成碎块状 ,或胞核固缩边缘化等典型的凋亡细胞特征性形态改变。存活的部分细胞线粒体增生 ,提示细胞功能活跃。同时 ,见到许多细胞浆内有空泡形成。结论 :三氧化二砷在体外能明显地抑制人 T淋巴细胞生长 ,这种生长抑制作用的机制之一是诱导细胞凋亡 ,可能也是砷的免疫毒性和免疫抑制作用的机制之一     

人rδT淋巴细胞抗肿瘤特性的研究

分别采用4h51Cr释放法及3H—TdR掺入法检测人rδT淋巴细胞对各种肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示：rδr细胞对XG—7、K562、Daudi、U937、Jurkat等肿瘤细胞株皆可介导高效杀伤作用；对自体及异体新鲜白血病细胞亦有明显的细胞毒效应；对正常的自体及异体淋巴母细胞却无明显的杀伤作用；同时，INF－α、IL－4等细胞因子可协同提高rδT细胞对肿瘤细胞的杀伤活性．