肝细胞癌GSTP1基因启动子区甲基化的研究

基因启动子区异常甲基化抑制转录是基因失活的又一机制，也是人类肿瘤发生的重要机制之一。肝细胞癌（HCC）发生的分子机制仍不十分清楚。我们采用甲基化特异性PCR（MSP法）检测了HCC中GSTP1基因启动子甲基化，探讨其在HCC发生中作用。     

大肠癌患者血清中p16基因启动子畸变甲基化的检测

目的　检测大肠癌患者血清DNA中p16基因启动子畸变甲基化 ,并探讨将它用于大肠癌早期诊断或作为一个预后因子的可能性。　方法　收集新鲜的大肠癌组织及其对应的血清标本5 2例 ,大肠腺瘤患者血清标本 34例 ,健康志愿者血清标本 10例。采用甲基化特异的PCR技术分别检测肿瘤组织DNA和血清游离DNA中p16基因启动子畸变甲基化的状况。分析血清中p16基因畸变甲基化与大肠癌临床病理特征的关系。　结果　 38% (2 0 / 5 2 )大肠癌组织出现p16高甲基化 ;与出现了高甲基化的组织标本对应的 2 0例血清标本中有 14例 (70 % )出现高甲基化 ,而其余 32例血清标本无一例检出高甲基化 (χ2 =30 7,P <0 0 1) ;34例大肠腺瘤患者和 10例健康志愿者的血清DNA中均未见p16高甲基化。血清p16基因高甲基化与大肠癌Dukes分期关系密切 (χ2 =5 7,P =0 0 3) ,但是与其它临床病理特征无关。　结论　大肠癌患者血清DNA中存在一定比例的p16基因启动子高甲基化。检测血清中p16基因的甲基化状况可能有助于大肠癌的早期发现或预后评估。     

膀胱癌DBCCR1、p16、p15、p14基因甲基化检测的意义

膀胱肿瘤患者9号染色体改变占60%以上,该染色体上分布着候选抑癌基因DBCCR1和抑癌基因p16、p15、p14.我们对4种基因5＇CpG岛甲基化状态进行了研究,现报告如下.     

p16基因启动子甲基化与结直肠癌发生发展的关系

目的　探讨p16基因启动子甲基化在结直肠癌发生、发展过程中的作用及其临床意义。方法　采用RT PCR、免疫组化方法检测p16基因表达 ,用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测p16基因启动子甲基化。结果　 5 8例结直肠癌中 ,癌旁肠粘膜、原发灶、肝转移灶中p16表达阳性率分别为97% (5 6 /5 8)、31% (18/5 8)、7% (2 /2 8) ,原发灶、肝转移灶中p16表达明显降低 (P <0 0 1)。癌旁肠粘膜组织中未发现p16基因启动子甲基化 ,而癌原发灶、肝转移灶中p16甲基化阳性率分别为 5 0 %(2 9/5 8)、75 % (2 1/2 8) ,3种组织p16基因启动子甲基化率的差别有显著性意义 (P <0 0 1)。在 2 8例出现肝转移者外周静脉血、胆汁中可检测到p16甲基化启动子序列者分别为 2 3例 (82 % )、2 0例 (71% )。结论　p16基因启动子甲基化导致p16抑癌基因失活与结直肠癌的发生、转移有密切关系。     

肝癌抑癌基因GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A异常甲基化检测及其临床意义

目的 研究肝细胞癌中的GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A 4种基因启动子区域甲基化状态的表达差异,并探讨其在肝癌发生中的作用.方法运用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR,MSP）技术,分别检测35例肝癌组织及其相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中4种候选抑癌基因（GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A）启动子区域的甲基化表达情况,并结合临床病理资料进行分析.结果在肝细胞癌、癌旁及正常对照肝组织中检测到GSTP1基因启动子区的甲基化率分别是57.1 （20/35）,25.7％（9/35）,0％ （0/20）;p16基因启动子区甲基化率分别是54.3％ （19/35）,37.1％ （13/35）,0％ （0/20）; RIZ1基因启动子区甲基化率分别是68.6％ （24/35）,14.3％ （5/35）,0％ （0/20）;RASSF1A基因启动子区甲基化率分别是88.6％ （31/35）,74.3％（26/35）,10％ （2/20）,其中癌组织中GSTP1和RIZ1基因甲基化率均显著高于相应的癌旁组（P＜0.01）和正常对照肝组织（P＜0.01）,癌组织中p16、RASSF1A启动子区甲基化率高于癌旁组织,但二者无统计学意义（P＞0.05）,但明显高于正常对照肝组织（P＜ 0.01）.在肝癌组织中肿瘤有包膜侵犯者GSTP1基因甲基化阳性率明显高于无包膜侵犯者（P＜0.05）;乙肝表面抗原（HbsAg）阳性的肝癌患者p16基因甲基化阳性的比率要显著高于HbsAg阴性者（P＜0.05）;而RIZ1、RASSF1A与临床病理资料间均没有统计学意义（P＞ 0.05）.结论RIZ1、GSTP1基因甲基化状态具有肝癌特异性,或可作为临床肝癌辅助诊断的分子标记物.慢性HBV感染可能是导致p16甲基化而失活的原因,GSTP1基因启动子甲基化可能与肝细胞癌的侵袭性有关.     

肝细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及mRNA表达的研究

目的 探讨细胞癌中WIF-1基因启动子甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应和实时定量逆转录-聚合酶链反应技术,检测33例肝细胞癌及相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中WIF-1基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平,分析上述组织WIF-1基因甲基化及mRN表达与临床资料的关系并分析甲基化对mRNA表达的影响。结果 WIF-1基因在癌组织中甲基化率明显高于癌旁组织和正常组织（Х^2=4．89,P〈0．05）,而癌旁组织和正常组织中WIF-1基因甲基化率相比无明显差异;癌组织中WIF-1基因甲基化与乙肝表面抗原、肝硬化有关;WIF-1基因mRNA表达量在三种组织中比较无明显差异。结论 WIF-1基因启动子甲基化与HCC的发生相关;WIF-1基因启动子甲基化与其mRNA表达的关系有待进一步研究。     

普鲁卡因酰胺诱导肝癌细胞启动子区甲基化的GSTP1基因重新表达

目的研究HepG2肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化与GSTP1基因表达的关系，并探讨普鲁卡因酰胺用于诱导因甲基化失活的GSTPI基因重新表达的可能性。方法分别用5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和普鲁卡因酰胺处理HepG2细胞后培养，甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞中GSTP1基因的甲基化状况，RT-PCR和Western blot分别检测细胞中GSIP1 mRNA和GST-π的表达。结果HepG2细胞在去甲基化药物处理前，GSIP1基因完全甲基化，GSTP1基因不表达；药物处理后，普鲁卡因酰胺组和5-Aza-CdR组GSTP1基因有表达。结论肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化可抑制GSTP1基因表达，普鲁卡因酰胺与5-Aza-CAR一样能使启动子区甲基化的GbTP1基因重新表达。     

原发性肝细胞癌中p16基因的缺失性研究

ｐ1 6基因是近年来发现的一个抑癌基因 ,目前已知道 ,在各种肿瘤中广泛存在着ｐ1 6基因的突变 ,基因缺失是其主要的突变形式。为探讨国人原发性肝癌与ｐ1 6基因的关系 ,我们应用ＰＣＲ方法对我院 2 5例原发性肝癌ｐ1 6基因缺失的情况进行了研究。材料与方法收集我院肝胆外科手术切除的肝癌标本 2 5例。标本离体后 ,立即于癌及癌旁组织取材 ,置液氮中保存所有标本均经手术及病理证实。取癌或癌旁组织少量 ,用酚—氯仿法抽提ＤＮＡ。用复合ＰＣＲ法对ｐ1 6基因进行扩增 ,β 肌动蛋白 (β ａｃｔｉｎ)作为内对照。用χ2 检验对实验结果进行统计…     

肝细胞癌组织中Ras相关区域家族蛋白1A、肿瘤高甲基化基因1和p73基因的异常甲基化

目的探讨肝细胞癌中RAS相关区域家族蛋白1A(RASSF1A)、肿瘤高甲基化基因1(H IC1)和P73基因启动子异常甲基化状况及其与患者临床和病理因素之间的关系。方法收集肝细胞癌组织标本和对应的远癌组织标本各40例及2例健康人的肝组织标本;通过甲基化特异的聚合酶链反应方法检测这些标本中RASSF1A、H IC1和P73基因启动子区的甲基化状况。结果RASSF1A基因在癌和远癌组织中启动子区的甲基化率分别为90.0%和72.5%,癌组织中的甲基化率高于远癌组织(P<0.05)。H IC1基因在癌和远癌组织中的甲基化率分别为77.5%和70.0%。P73基因在癌组织中甲基化率为5.0%,在远癌组织没有发现甲基化。健康人肝组织中未发现任何上述基因的异常甲基化。远癌组织中H IC1基因甲基化患者的年龄[(48±14)岁]比无甲基化患者[(57±11)岁]小(T=2.049,P=0.047)。3个基因甲基化发生情况与患者性别、是否合并乙型肝炎、肝硬化、甲胎蛋白水平、肿瘤大小、有无包膜和门静脉癌栓以及TNM分期之间未发现有统计学相关性。结论肝细胞癌中RASSF1A和H IC1基因启动子的高甲基化是普遍现象,年轻肝细胞癌患者H IC1甲基化现象更常见。     

肝细胞癌中APC基因启动子甲基化和mRNA表达检测

目的探讨肝细胞癌中APC基因启动子甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测30例肝细胞癌及相应的癌旁组织和10例正常对照肝组织中APC基因启动子甲基化状态和mRNA表达水平,分析甲基化与临床资料以及与mRNA表达的关系。结果在肝细胞癌、癌旁及正常对照肝组织中检测到APC基因启动子甲基化率分别是46.6%、16.6%、0%。肝细胞癌组织中APC基因启动子甲基化率明显高于相应的癌旁和对照组(P<0.05),并且与年龄和癌肿有无假包膜有相关性(P<0.05)。各组织中APC基因mRNA表达无显著差异。结论APC基因启动子甲基化与肝细胞癌形成和侵袭有关,但不影响癌组织中mRNA表达。     

肝细胞肝癌中p15、p16基因表达的关系

目的 探讨ｐ１５,ｐ１６基因在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）的表达情况,相互关系及其临床病理意义。方法 用免疫组织化学方法（ＳＡＢＣ法）检测了ｐ１５,ｐ１６基因在３０例ＨＣＣ标本中的表达。结果 ｐ１６,ｐ１５基因在ＨＣＣ的阳性表达率在肿瘤分级及及临床分期的差异中均有显著意义。结论ｐ１５,ｐ１６基因的异常表达在ＨＣＣ中的发生,发展过程中起重要作用,二者在ＨＣＣ中的表达具有不均衡性。     

肝细胞癌中抑癌基因的甲基化现象

目的 了解肝细胞癌(HCC)中RASSF1A、DAPK、FHIT、RIZ1和p73基因的甲基化状况.方法 应用甲基化特异性PCR技术,检测40例HCC和4例正常肝组织中5种基因启动子区域的甲基化状况,并分析每种基因甲基化程度和临床参数之间的关系.结果 正常肝组织中无基因甲基化.癌组织中,RASSF1A、DAPK、FHIT、RIZ1和p73基因的甲基化率分别是:90%、77.5%、70%、30%和5%.相应癌旁组织中,RASSF1A、DAPK、FHIT、RIZ1和p73的甲基化率分别为77.5%、77.5%、62.5%、5%和0%.结论 HCC中多基因的启动子甲基化是一种普遍的事件.     

肝细胞癌MGMT、DAPK、THBS1和RIZ1基因甲基化研究

目的了解肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma, HCC)中MGMT、DAPK、THBS1和RIZ1基因的甲基化状况。方法应用甲基化特异性PCR(methylation specificPCR,MSP)技术,检测40例HCC和2例正常肝组织中4种基因启动子区域的甲基化状况,并分析每种基因甲基化程度和临床参数之间的关系。结果正常肝组织中无基因甲基化。肝癌组织中,MGMT、DAPK、THBS1和RIZ1基因的甲基化率分别是15%、77 5%、37 5%和30%。且87 5%的HCC中至少有一种基因甲基化。相应癌旁组织中,MGMT,DAPK,THBS1和RIZ1的甲基化率分别为5%、77 5%、27 5%和5%。RIZ1基因癌组织中的甲基化率明显高于癌旁组织(χ2 =8 658,P<0 05)。有2种基因甲基化的患者年龄较有1种基因甲基化组的年轻(t=2 389,P<0 05 )。有THBS1基因甲基化的患者年龄较无此基因甲基化组的年轻(t=3 047,P<0 05)。结论HCC中多基因的启动子甲基化是一种普遍的事件。     

胰腺癌中p16基因甲基化改变及其蛋白表达分析

目的:探讨胰腺癌与癌旁组织中p16基因启动子区异常甲基化的改变及其蛋白表达的特点,以及其与胰腺癌发生发展的关系。方法:分别采用免疫组化SP法及甲基化特异PCR(MSP)检测46例人胰腺癌和癌旁组织中p16基因表达及其甲基化的水平,并结合临床资料进行分析。结果:胰腺癌中p16蛋白表达率为41.3%(19/46),而癌旁组织表达率为95.7%(44/46),两者有差异显著性(P<0.01)。p16蛋白阳性的19例胰腺癌标本中均未检出基因甲基化;p16蛋白缺失的27例标本中有18例检出基因甲基化,甲基化率为39.1%。p16基因甲基化与蛋白缺失有明显关系(P<0.05)。p16基因表达及其启动子区甲基化的发生率与胰腺癌的大小,患者性别﹑年龄的差异无显著意义(P>0.05),但与组织分化程度﹑淋巴结转移﹑PTNM分期有显著意义(P<0.05)。结论:p16基因启动子的异常甲基化可影响p16蛋白的表达,它们与胰腺癌的发生发展有关;p16甲基化和蛋白表达可能成为胰腺癌诊断及预后的候选标志物之一。     

肝细胞癌与乙肝病毒基因整合和p16基因表达的相关性研究

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合与p16的关系及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法：聚合酶链式反应（PCR）检测35例肝癌、癌旁组织及31例肝硬化组织中HBV DNA及其整合情况，以Southern blot证实；逆转录－聚合酶链式（RT－PCR）检测组织中p16 mRNA。结果：有HBV DNA整合的肝癌、癌旁及肝硬化组织中X基因整合分别为100．0％、81．8％及68．4％，三者差异有显著性（P＜0．05）；p16 mRNA的表达缺失率分别为51．4％、31．4％、22．6％，三者差异有显著性（P＜0．05）。结论：HBV DNA整合与p16基因表达改变有相关性，两 者在肝癌的发生发展中发挥重要作用。     

肝细胞癌患者血浆FHIT、SLIT2基因启动子甲基化的检测及意义

目的 探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者外周血浆中FHIT和SLIT2基因启动子甲基化状态及其临床意义.方法 应用甲基化特异性PCR(MSP)检测36例HCC患者血浆及10例健康对照者血浆中FHIT和SLIT2的基因启动子甲基化状态,并分析其与临床参数的关系.结果 36例 HCC患者外周血浆中FHIT和SLIT2的基因启动子甲基化率分别为50.0%(18/36)和27.8%(10/36);10例健康对照者血浆中均未检出基因甲基化改变.外周血浆中FHIT和SLIT2基因甲基化发生率与性别、年龄、HBV感染、肝硬化、肿瘤大小、甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤病理分级及临床分期、有无癌栓及是否为复发病例之间无统计学相关性.联合AFP和血浆中FHIT和SLIT2基因甲基化检测诊断HCC敏感性达86.1%,高于单独应用AFP检测的诊断敏感性(61.1%)(P＜0.05,χ2=5.79).结论 HCC患者外周血浆中可检测到FHIT、SLIT2基因甲基化改变,与临床参数无相关性.联合AFP及血浆DNA甲基化检测可提高HCC的诊断敏感性.     

肝细胞癌中SLIT2基因甲基化状态研究

目的 SLIT2基因甲基化已在多种肿瘤中被发现,我们拟了解肝细胞癌(HCC)中SLIT2基因的甲基化状态及临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术,检测50例HCC癌组织及相应的癌旁组织,4个HCC细胞系, 8例肝血管瘤旁和4例供肝组织,了解SLIT2基因在上述组织中的甲基化状态,并分析其与临床资料间的相关性。结果 8例肝血管瘤旁和4例供肝组织均未发生甲基化,4个HCC细胞系有3个出现甲基化。50例HCC癌组织及其相应的癌旁组织中, 分别检测到39例(78％)和26例(52％)发生甲基化;癌组织与癌旁组织甲基化率比较,有显著统计学差异(P=0．006);TNM Ⅲ期组SLIT2甲基化率高于TNM Ⅰ／Ⅱ期组(P=0．035);甲基化阳性组的半年无瘤生存率低于阴性组,但差异无统计学意义 (P=0．208)。结论 SLIT2基因甲基化是HCC中的频发事件,可能参与HCC的发展。     

原发性肝细胞癌病人血浆P16甲基化的意义

目的 探讨原发性肝细胞癌病人血浆P^16甲基化的临床意义。方法 2001年4月至2004年1月，应用甲基化特异PCR法检测35例原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）病人肿瘤、肿瘤旁组织及血浆中P^16甲基化的表达状况。结果 P^16甲基化阳性率HCC癌组织34％明显高于癌旁肝硬化／慢性肝炎组织11％（P〈0．01）。50％HCC癌组织P^16甲基化病人血浆可检测到P^16甲基化。血浆P^16甲基化阳性率在血清AFP定量呈正常（AFP〈200μg／L）的19例HCC病人为21％。HCC癌组织，血浆P^16甲基化阳性病人术后1年复发的相对危险度是P^16甲基化阴性的3．34倍（95％的可信区间1．49～8．00），2．69倍（95％的可信区间1．40～5．14）。结论 HCC血浆中P^16甲基化可能与HCC术后复发相关，可能是微创监测HCC术后复发的分子标记物。检测血浆P^16甲基化有助于对血清AFP〈200μg／L的肝癌病人有诊断价值。     

肝细胞癌中HBX和MATs基因启动子甲基化的关系

目的 观察肝细胞癌(HCC)中乙肝病毒X蛋白(HBx)、甲硫氨酸腺苷转移酶1A(MAT1A)和甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)的表达以及HBx对MAT1A、MAT2A基因启动子的甲基化状态的影响,探讨HCC中MATs发生转化的机制.方法 应用免疫组织化学法检测78例乙型肝炎病毒(HBV)阳性HCC组织中HBx、MAT1A、MAT2A的表达,并用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)法检测上述组织中MAT1A、MAT2A的甲基化状态,并将上述检测结果进行相关分析.结果 免疫组织化学结果表明,在78例HCC组织中,HBx、MAT1A、MAT2A阳性表达分别为59例(75.64%)、17例(21.79%)和66例(84.62%);HBx表达和MAT1A表达为负相关(P＜0.05),和MAT2A表达为正相关(P＜0.05),MAT1A和MAT2A表达为负相关(P＜0.05);MS-PCR结果表明,78例HCC组织中,MAT1A甲基化占58例(74.36%),MAT2A甲基化为9例(11.54%),HBx表达和MAT1A启动子甲基化状态呈正相关(P＜0.01),和MAT2A启动子甲基化状态呈负相关(P＜0.01).结论 HBx同MAT1A、MAT2A的表达明确相关,它能通过某些途径引起MAT1A启动子高甲基化、MAT2A启动子低甲基化来改变MATs的表达状态.

Abstract：

Objective To investigate the effect of hepatitis B virus x-protein (HBx) on the expression of MATs, the methylation status of methionine adenosyltransferases (MATs) ' promoters in hepatocellular carcinoma ( HCC), and the possible mechanism of MATs' change in HCC. Methods The expression of HBx, MAT1 A and MAT2A was detected in 78 HBV-positive HCC samples by IHC method and their correlation was analyzed. The methylation status of the promoters of MAT1A and MAT2A was examined. Results In 78 HCC tumor specimens, the positive expression rate of HBx, MAT1A and MAT2A was 75.64% (59 cases), 21.79% ( 17 cases) and 84. 62% (66 cases). There was a negative correlation between the expression of HBx and MAT1A (P ＜0. 05), a positive correlation between HBx and MAT2A ( P ＜ 0. 05), a negative correlation between MAT1A and MAT2A ( P ＜ 0. 05 ). MS-PCR revealed that there were 58 cases of MAT1A promoter' hypomethylation (74. 36% ), 9 cases of MAT2A promoter' hypomethylation ( 11.54% ). The positive expression of HBx was positively related with promoter' hypomethylation of MAT1A (P ＜ 0. 01 ), but negatively with promoter' hypomethylation of MAT2A ( P ＜ 0. 01 ).Conclusion The expression of HBx has relationship to the expression MAT1A and MAT2A in HCC tumor tissues, which is contributed to the fact that HBx can change the methylation status of MATs' promoters by some unknown pathways.     

沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16|RASSF1A基因启动子甲基化的影响

目的:探讨沉默DNMT1和DNMT3b基因对胰腺癌BxPC-3细胞p16,RASSF1A基因启动子甲基化的影响。方法:将胰腺癌BxPC-3细胞分为5组:DNMT1干扰组(转染DNMT1-siRNA),DNMT3b干扰组(转染DNMT3b-siRNA),双重干扰组(转染DNMT1+DNMT3b-siRNA),阴性对照组(转染阴性siRNA)和空白对照组(转染脂质体)。转染48 h后,应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中DNMT1和DNMT3b的mRNA及蛋白的表达水平;甲基化特异性PCR法检测p16和RASSF1A基因启动子甲基化。结果:与空白对照组和阴性对照组比较,各干扰组目的基因的mRNA及蛋白表达量均明显降低(均P<0.01)。空白对照组与阴性对照组p16和RASSF1A基因甲基化阳性;DNMT1干扰组和双重干扰组p16基因甲基化阴性,RASSF1A基因部分甲基化;DNMT3b干扰组p16基因部分甲基化,RASSF1A基因甲基化阳性。结论:DNMT1单干扰对胰腺癌BxPC-3细胞p16和RASSF1A基因的去甲基化作用优于DNMT3b单干扰,DNMT1和DNMT3b双重干扰无明显的协同效应;提示DNMT1是胰腺癌去甲基化治疗的一个有效靶点。