温度对脊尾白虾胚胎及幼体发育的影响研究

为进一步阐明脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的繁殖生物学习性, 作者分别以脊尾白虾受精卵和初孵幼体为实验对象, 研究了温度对脊尾白虾胚胎发育及幼体发育的影响。结果表明, 温度对孵化时间及胚胎孵化率影响显著(P<0.05): 在实验温度范围内(19～31℃), 胚胎发育进程随温度升高而加快, 19℃和31℃条件下胚胎孵化时间分别为(536.50±18.33) h 和(218.68±5.51) h; 胚胎孵化率在25℃下最高为64.11%±12.54%, 较高(28～31℃)和较低(19～22℃)温度下的胚胎孵化率显著降低。温度对脊尾白虾幼体发育影响显著(P<0.05): 在16～32℃范围内, 体长增长率随温度的升高而增加, 但幼体发育持续时间随温度的升高而减少, 16℃和32℃条件下幼体变态为仔虾所需时间分别为孵化后(27.60±0.22)d和(7.75±0.07)d, 较低温度范围内(16～28℃)P₁变态存活率随温度升高而升高, 28℃的P₁变态存活率最高达91.67%±7.64%。但当温度继续升高时, 幼体的变态存活率急剧降低, 36℃时幼体不能变态为仔虾。根据曲线拟合方程推算的最适胚胎发育和幼体发育温度分别为25.33℃和27.60℃。本实验结果可以为脊尾白虾人工育苗的管理提供参考和依据。     

脊尾白虾的幼体发育

脊尾白虾(白虾、青虾、晃虾、绒虾)生活于泥沙底之近岸浅海或河口附近,在我国沿海均有分布,其中北方沿海产量甚大,仅次于毛虾、中国对虾和鹰爪虾,是重要的经济虾类之一。 由于脊尾白虾对温度和盐度的适应范围广、食性杂、繁殖力强、生长迅速,有希望成为人工增养殖的优     

脊尾白虾的行为学观察研究

在高密度室内饲养条件下,观察了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的摄食、相残、运动、蜕皮、间隔、攻击和防御行为。试验结果表明,脊尾白虾摄食行为活跃,运动行为多样,在饥饿或个体较大差异条件下具有一定程度的相残行为,蜕皮行为表现出一定的特殊性,常经数天多次蜕皮行为特征后才能将旧壳蜕下,间隔行为不明显,攻击频率不高。另外,通过设置不同投喂组和投喂间隔时间观察比较了索饵率和相残率,结果表明,索饵率在第8小时已基本达到最高,相残率随投喂间隔时间的延长和空间密度的增大而升高。     

脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞c DNA文库中的C-型凝集素基因EST序列,采用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因c DNA全长,命名为Ec CTL。该基因全长1285 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸组成的蛋白质,分子量为38.56 k Da,为甘露糖型凝集素。同源性分析表明,脊尾白虾Ec CTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高,达到91%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec CTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达,其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)后6~12 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec CTL的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用,为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。     

pH 胁迫对脊尾白虾抗氧化酶活力的影响

为了了解pH胁迫下脊尾白虾(Palaemon(Exopalaemon)carinicauda Holthuis)的适应性,作者采用静水毒性的实验方法确定了脊尾白虾的半致死pH,分析了pH胁迫对脊尾白虾抗氧化酶活力的影响。设置pH4~11.1共17个胁迫组,统计脊尾白虾24、48、72和96 h的死亡率。结果显示,脊尾白虾24、48、72和96 h酸性半致死pH值分别为4.25、4.64、4.71和4.78,碱性半致死pH分别为10.87、10.55、10.38和10.29。将脊尾白虾暴露于低pH 6.5、高pH9.5的水体,以pH8.0作为对照,分别于胁迫后0、3、6、12、24、48、72和96 h测定鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴中总抗氧化力、过氧化氢酶、抗超氧阴离子活力。结果发现,pH胁迫后,在3~6 h内各组织中抗氧化酶活力均显著上升,24~48 h开始回落,到96 h之前,各组织中抗氧化酶水平基本恢复到对照组水平。整个实验过程中肝胰腺中抗氧化酶活力水平明显高于其他组织。本实验结果表明,脊尾白虾对pH有很强的适应性,pH胁迫3~24 h之内抗氧化酶活力反馈性升高清除体内多余的活性氧。     

脊尾白虾Dnmt2启动子克隆及其转录调控分析

为探明脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) Dnmt2 (DNA methyltransf-erase2, Dnmt2)启动子对Dnmt2转录的调控作用, 本研究利用染色体步移技术克隆得到脊尾白虾Dnmt2启动子, 使用在线软件预测该基因启动子区域的转录调控元件及转录因子结合位点, 通过构建一系列缺失表达载体, 利用双荧光素酶报告基因检测技术鉴定了该基因核心启动子区, 并对其启动子活性进行检测。结果表明, 克隆的脊尾白虾Dnmt2启动子长度为1315 bp, 转录起始位点“A”位于ATG上游236 bp, 启动子区域含有多种转录因子结合位点, 包括STAT3、SOX、NF-κB、E2F、GATA-1等, 但缺乏CpG岛。双荧光素酶报告基因检测显示, Dnmt2核心启动子区位于–196~+81 bp, 对启动子区域进行活性检测发现, 在该基因启动子–640~–452 bp区域内可能存在促进基因表达的转录调控元件, 而在–1160~ –640 bp区域可能存在抑制该基因表达的转录调控元件。本研究结果为进一步研究Dnmt2启动子的表达调控机制提供理论依据。     

恩诺沙星对脊尾白虾APND、ECOD和GST活性的影响

为研究脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)药物代谢酶对恩诺沙星的响应及其在恩诺沙星代谢过程中的作用,作者以10、20和40 mg/kg恩诺沙星连续投喂脊尾白虾3 d,于投喂后的第1、2天以及停止投喂药物的第1、4、8、12、24、48、72、120小时取样,测定了脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清中的氨基比林-N-脱甲基酶(aminopyrine-N-demethylase,APND)、7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(7-ethoxycoumarinO-Deethylase,ECOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)的活性。结果表明:不同浓度恩诺沙星对脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清中Ⅰ相药物代谢酶APND和ECOD活性均呈现显著抑制作用(P0.05)。投喂药物后,APND和ECOD活性呈现先下降后逐渐上升趋势,3个剂量组酶活性均在最后一次给药后8 h达到最低。与对照组相比,不同浓度恩诺沙星对各组织中Ⅱ相药物代谢酶GST活性呈现显著诱导作用(P0.05),此作用呈现先上升后下降的趋势。恩诺沙星对脊尾白虾APND、ECOD及GST活性的作用均呈现剂量依赖性。本研究表明,脊尾白虾Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶均会对药物做出反应,可作为其养殖过程中药物代谢及适用性的指示物。     

白斑综合征病毒对脊尾白虾的致病性研究

2010年、2011年江苏沿海多数地方海水养殖中发生了脊尾白虾大规模死亡的现象,本课题通过对患暴发性流行病的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)进行病毒分子生物学检测,发现病虾体内白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,简称WSSV)检测普遍呈阳性;应用发病虾组织制备的病毒粗提液,进行了人工感染实验,实验表明该病毒对脊尾白虾具有较强的致病性,可引起68.5%的死亡率。电镜结果表明,发病虾与感染病虾鳃及肝胰脏等组织器官都发生了相同的细胞病理变化,主要表现为细胞核内染色质边聚、线粒体肿胀、内嵴消失等一系列细胞病理变化,在其细胞核与细胞质中发现了具有单层囊膜结构的对虾白斑综合征病毒粒子,病毒粒子大小约为(130~170)nm×(305~405)nm,核衣壳呈子弹形,一端较细另一端较粗,完整病毒粒子由核心、衣壳和囊膜构成,分子生物学实验表明该病毒为WSSV。实验结果符合柯赫氏法则,可以初步推断WSSV感染脊尾白虾并与引发的大规模死亡有着直接关系。     

人工培育脊尾白虾蚤状幼体的饵料基础研究

通过脊尾白虾蚤状幼体饵料种类，饵料组合和食物密度的比较试验，研究了脊尾白虾育苗的适宜开口饵料和育苗期饵料组合，测定了不同时期蚤状幼体的捕食率及其日粮。结果表明：饵料种类对脊尾白虾蚤状幼体Ⅰ期（Z1)至Ⅱ期（Z2）的变态率和变态所需时间没有明显影响，Z1可以不投饵，但适量投喂单胞藻或轮虫，能明显提高Z2活力和Z2至Z3的变态率。人工培育脊尾白虾蚤状幼体的适宜饵料是卤虫无节幼体，在幼体培育前期（Z1）投喂单胞藻，轮虫，后期（Z3以后）添加鱼糜效果也很好。蚤状幼体对卤虫无节幼体的捕食率和日粮随幼体发育而明显增加，同一发育时期则随饵料密度的增大而增加，但达到一定密度后，捕食率增幅明显下降。根据幼体日粮难以确定育苗期间卤虫无节幼体的最佳投喂方案。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢发育中的表达分析

VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。     

脊尾白虾精子体外保存的研究

采用精子存活率和顶体酶活力两种评价精子质量方法,研究了不同稀释剂与抗冻保护剂对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)精子体外保存效果的影响。结果表明：稀释剂Ⅰ-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率为71.50%,顶体酶活力为1.803μIU/106,两种指标值均高于其他实验组,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性显著γ=0.846(P<0.05);在液氮-196℃下保存2 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率达83.50%,顶体酶活力为2.507μIU/106,两种指标值均高于其他各组以及4℃下稀释剂Ⅰ组同期保存效果,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,γ=0.862(P<0.01)。15%DMSO为脊尾白虾精子超低温保存的最佳抗冻保护剂,此条件下超低温保存2 d后,精子存活率为81.32%,顶体酶活力为1.385μIU/106,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,相关系数γ=0.864(P<0.01)。     

脊尾白虾白斑综合征病毒耐受群体重要免疫相关酶的活性分析

白斑综合征(white spot syndrome,WSS)的爆发已给虾类养殖业造成了严重经济损失,寻找能够指示虾类群体抗白斑病能力的指标对虾类养殖业具有重要意义。本研究以脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda Holthuis)为实验材料,以人工注射白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)攻毒后稳定存活的脊尾白虾作为WSSV耐受群体(命名为Rm),以注射PBS的虾作为对照群体(命名为Vm),分析比较了Rm群体和Vm群体的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性差异以探讨筛选对虾抗病免疫指标的可行性。Rm群体的ACP和AKP活性均显著低于Vm群体(P0.05),而两群体在SOD活性上无显著差异。为进一步检验WSSV耐受群体是否比未经历过病毒感染的虾具有更高的抗WSSV的能力,作者以实验室养殖过程中经过WSSV自然感染后存活的脊尾白虾作为抗性群体(命名为Rn),以未经历过WSSV感染的脊尾白虾作为普通群体(Vn),进行WSSV人工注射攻毒,观察它们在WSSV感染后的存活率,结果显示Rn群体攻毒后存活率为33.2%,显著高于Vn群体的存活率15.1%(P0.05),说明ACP和AKP有可能作为虾类抗WSSV能力的评价指标。     

低盐胁迫对脊尾白虾过氧化氢酶和硒谷胱甘肽过氧化物酶基因表达的影响

过氧化氢酶(CAT)和硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GPx)在抗氧化防御体系中扮演重要的角色,在清除多余的活性氧自由基(ROS)防止机体氧化损伤方面具有重要的作用.本文利用RACE-PCR方法首次从脊尾白虾肝胰腺组织中克隆获得了CAT cDNA全长序列,该基因全长2649 bp,包括5′非编码区(UTR) 78 bp、开放阅读框(ORF)1554 bp和3′非编码区(UTR) 1017 bp,共编码517个氨基酸,预测分子量为58.46 kDa,理论等电点为6.64,利用PROSITE tools预测CAT基因的功能位点,发现该氨基酸序列包括酶活性中心序列“FDRERIPERVVHAKGAG”,亚铁血红素结合信号序列“RLFSYPDTH”和 3个催化位点残基His⁷¹,Asn¹⁴⁴和Tyr³⁵⁴.同源性分析表明,脊尾白虾CAT氨基酸序列与其他物种的相似性为68%-92%.荧光定量PCR分析结果表明,CAT基因在肝胰腺、血细胞、心脏、肌肉、卵巢、鳃、胃和眼柄均有表达,其中在肝胰腺中表达量最高.低盐胁迫后脊尾白虾鳃和肝胰腺中CAT和GPx基因分别在48 h和6 h达到最大值,且与对照组差异显著(P< 0.05),表明CAT和GPx基因参与了低盐胁迫反应,并表现出一定时间效应关系.综合分析结果指出脊尾白虾CAT基因是CAT家族主要成员之一,可能在低盐环境胁迫过程中具有重要的作用.