鸡蛋过敏原分离、鉴定与纯化

目的 对鸡蛋中主要过敏原进行分离、鉴定与纯化.方法 分别提取鸡蛋的蛋清与蛋黄的蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离鸡蛋的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting,wB)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对鸡蛋主要过敏原进行初步纯化.结果 WB检测显示,蛋黄与鸡蛋过敏患者的阳性混合血清没有反应;蛋清中有4条蛋白带起反应,分子量分别为83,71,38,13 kD,尤以13 kD的蛋白质最为明显,离子交换层析可初步纯化出13 kD的过敏原蛋白.结论 鸡蛋的主要过敏原为13 kD的蛋白质,为临床诊断和治疗鸡蛋过敏性疾病提供标准化的过敏原提供了基础依据.     

点带石斑鱼过敏原分离、鉴定与纯化

目的 对点带石斑鱼的主要过敏原进行分离、鉴定与纯化.方法 通过十二烷基硫酸钠-聚丙炳酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离点带石斑鱼的蛋白质组份,采用免疫印迹(western-blotting)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对主要过敏原进行初步纯化.结果 SDS-PAGE结果显示,点带石斑鱼粗提液含有13条蛋白带,含量高的有8条,分子量分别为43,34,28,25,22,17,15,9 kD;westem-blotting显示,对点带石斑鱼过敏患者的阳性混合血清能与其中4个蛋白条带起反应,分子量分别为34,28,24,22 kD.离子交换层析可初步纯化出22 kD的过敏原蛋白.结论初步分离得到分子量为22 kD的点带石斑鱼主要过敏原,为临床诊断和治疗鱼类过敏性疾病提供理论依据.     

枝孢芽枝菌主要过敏原的分析与免疫、质谱鉴定

目的分析并用免疫和质谱方法鉴定枝孢芽枝菌(Cladosporium cladosporioides)的主要过敏原。方法空气中暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,经鉴定后大规模培养;用碳酸盐缓冲液提取枝孢芽枝菌蛋白,并用SDS-PAGE、Western-blotting方法鉴定出枝孢芽枝菌的主要过敏原。主要过敏原胶内酶切,再经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,所得质谱数据进入网站(http://www.matrixscience.com)Mascot检索比对。结果经过暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,其蛋白粗提液SDS-PAGE结果显示有14个条带,含量丰富的有10个条带;Western-Blotting鉴定出18kD的蛋白阳性率达66%,为枝孢芽枝菌的主要过敏原;质谱显示枝孢芽枝菌主要过敏原与约18kD嗜冷杆菌(Psychrobacter arcticum)50S的核糖体蛋白的匹配分值最高。结论采用免疫、质谱法鉴定了枝孢芽枝菌的主要过敏原是约18kD的核糖体蛋白。     

大黄鱼过敏原的提取、分离及免疫学特性鉴定

目的提取、分离大黄鱼特异性过敏原成分,并对其免疫学特性进行鉴定。方法采用Coca’s提取液提取大黄鱼蛋白;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析大黄鱼总蛋白的组成,以对鱼过敏患者阳性血清为一抗,Western-Blotting分析大黄鱼中的过敏原;阴离子交换层析对大黄鱼总蛋白进行初步分离,Western-Blotting分析各个组份的免疫学活性。结果大黄鱼粗浸液蛋白分子量在8～116kD之间;Western-Blotting检测到分子量为54、29、27和14kD的过敏原;通过离子交换层析分离,过敏原蛋白的相对含量有显著提高,且大多都保持原有的免疫学活性。结论研究发现了大黄鱼中多种过敏原并对其免疫学活性进行了鉴定。     

鲤鱼主要变应原的分离、鉴定与纯化

目的 对常见的食物过敏原鲤鱼进行特异性抗原成分的分离、鉴定和纯化，为临床诊断及治疗鲤鱼过敏症提供理论依据。方法 通过磷酸盐缓冲溶液进行提取、用十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离出多种蛋白组分并测定其分子量；采用蛋白印迹技术（Western-blotting）鉴定其变应原并通过DE52离子交换层析对鲤鱼变应原进行初步纯化，进一步经凝胶过滤层析对变应原混合组分进行纯化。结果 SDS-PAGE分离出14种蛋白组分，其中主带有9条，分子量分别为5，46，36，34，26，25，23，20，16kDa。Western—blitting结果显示，鲤鱼的主要变应原及次要变应原的分子量是42，36kDa的变应原组分。结论 鲤鱼主要特异性变应原为42和36kDa的蛋白质，为临床诊断和治疗鱼类过敏性疾病提供标准化的廊原尊定了基础．     

小鼠截短型CDC25B蛋白PKA体外磷酸化分析

目的通过体外磷酸化研究和放射自显影技术证实小鼠CDC25B蛋白是蛋白激酶A(PKA)的直接作用底物。方法构建小鼠截短型pGEX-4T-2-CDC25B201原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化CDC25B蛋白,与PKA进行体外磷酸化反应,分别采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印迹(western blot)和放射自显影鉴定CDC25B是否为PKA直接磷酸化底物。结果在E.coli BL21细胞内,采用0.1 mmol/L的IPTG在27℃条件下诱导表达3 h即可达到较高表达水平;SDS-PAGE显示在约50 kD处有明显GST-CDC25B201融合蛋白特异条带;放射自显影显示GST-CDC25B201融合蛋白的磷酸化条带大约位于55 kD处;Western blot分析,在重组质粒表达的总蛋白、载体表达的GST蛋白、纯化蛋白及磷酸化蛋白的相应位置均出现GST抗体的杂交条带。结论小鼠CDC25B蛋白是PKA的直接作用底物。     

鳙鱼过敏原小清蛋白基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的克隆、表达与纯化鳙鱼(Aristichthys nobilis)过敏原小清蛋白,并检测免疫学活性。方法提取鳙鱼的总RNA,设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,克隆入T载体中进行测序和分析。将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体中于E.coli BL21(DE3)表达。通过Ni2+亲和层析,对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(Western-blotting)方法检测其IgE结合活性。结果获得了鳙鱼过敏原小清蛋白基因,该基因被GenBank收录,登陆号FJ013047。基因开放阅读框共330个碱基(包括终止密码子),编码109个氨基酸,相对分子质量为11 537。Western-blotting结果表明,纯化后的重组蛋白能与过敏性患者血清中的特异性IgE结合。结论成功克隆、表达、纯化鳙鱼过敏原小清蛋白,此重组蛋白具有良好的免疫原性。     

杂色曲霉菌变应原分离、鉴定及纯化

目的 对杂色曲霉菌变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化.方法 提取杂色曲霉菌蛋白质,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,用免疫印迹(western-blot)鉴定变应原成分,用western-blot法鉴定出了6种变应原,通过离子交换和凝胶过滤层析纯化变应原.结果 碳酸氢盐-盐水提取液(Coca'...     

PTD-Lmp-3融合蛋白的纯化、表达和鉴定

目的构建融合蛋白PTD-Lmp-3的表达质粒,并进行诱导表达、纯化及鉴定。方法利用基因重组技术构建pET43.1a-PTD-Lmp-3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni2＋-NTA层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白。结果成功构建了表达质粒pET43.1a-PTD-Lmp-3,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,经IPTG诱导表达的总菌体蛋白在融合蛋白的相应位置PTD-LMP-3约为22 kD,可溶性分析发现融合蛋白主要以上清形式存在,纯化后得到了目的蛋白。Western blot鉴定显示表达蛋白具有抗原性。结论成功构建了PTD-Lmp-3的重组表达载体,使融合蛋白在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为进一步研究奠定了基础。     

刀额新对虾变应原的分离、鉴定与纯化

目的通过对我国常见的刀额新对虾变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化，以提供虾特异性变应原用于食物变态反应疾病的诊断和治疗。方法通过十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分离刀额新对虾的蛋白质组分并测定其分子量，收集过敏病人血清，采用免疫印迹（Western—blotting）法鉴定其变应原成分，通过离子交换层析对刀额新对虾变应原进行初步纯化，通过疏水层析和凝胶过滤层析进一步对变应原纯化。结果刀额新对虾有17条蛋白带，其中主要条带有10条，68和36kD为可与虾过敏性病人血清IgE结合的特异性变应原；通过各种层析方法纯化出刀额新对虾68kD变应原，纯度为96％。结论对刀额新对虾变应原进行分离、鉴定和纯化，得到高纯度的68kD刀额新对虾变应原。为临床虾变态反应疾病的诊断和治疗奠定基础。