含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达

目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV 2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT-PCR方法检测重组复制子的HCV RNA负链,采用Western blot检测HCV NS3蛋白的复制表达,并观察IFN-α对重组质粒表达的HCV RNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCV NS3蛋白表达。转染后48h,1 000IU/ml和2 000IU/ml IFN-α处理的细胞HCV RNA表达水平分别为未处理组的20.0%和7.6%。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh-7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台。     

干扰素-敏感决定区域位点特异性的突变可调节丙型肝炎病毒的复制

丙型肝炎病毒（HCV）非结构性的5A（NS5A）基因中干扰素，敏感决定区域（ISDR）氨基酸被替换的数目与干扰素应答以及病毒载量有密切关系。一些研究HCV复制的章已经指出，体外实验发现ISDR序列可影响病毒的复制。但是．不同的ISDR序列如何影响HCV的复制还不清楚。各种临床观测到ISDR序列被插入HCV复制子，它们的组合对病毒复制的影响采用克隆形成实验或瞬时测定复制情况法来测定。     

HepG2细胞中HCV NS5A蛋白对HCV IRES启动蛋白翻译的影响

目的探讨HepG2细胞中HCV非结构蛋白5A（NS5A）对HCV IRES启动蛋白翻译的影响，以了解HCV的复制调控机制。方法将构建的表达双荧光素酶的双顺反子载体pCMV-Rluc-IRES-Fluc和含HCV NS5A基因的表达质粒pcDNA-NS5A共转染HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，细胞免疫荧光技术检测HCV-NS5A蛋白的表达，RT-PCR检测虫荧光素酶基因mRNA水平，并与相应对照做比较，以观察HCV NS5A对HCV IRES介导虫荧光素酶翻译水平的影响。结果转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞中虫荧光素酶活性明显高于转染pCDNA3．I-3flag的对照组，并存在剂量依赖关系；而RT-PCR虫荧光素酶基因mRNA水平在两组间差异无统计学意义。转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞质中可见HCV NS5A蛋白的表达。结论HCV NS5A蛋白对HCV IRES介导虫荧光素酶的翻译有正调节作用，并存在剂量依赖关系．     

变异的非结构蛋白对干扰素调节因子3的作用

目的研究一种变异的流感病毒非结构蛋白（NS1）对干扰素调节因子3（IRF-3）抑制作用的影响.方法用A/FM/1/47、A/HK/1/68、A/HK/1/68-MA20、A/HK/1/68-MA20C和阳性对照Sendai病毒（SV）感染HEK293细胞,Western blot比较这些病毒感染后磷酸化的迁移较慢的IRF-3Ⅲ和Ⅳ型是否出现.亚克隆A/HK/1/68的野生型NS1和A/HK/1/68-MA20的变异型NS1至pcDNA3.1-flag构建flag-NS1野生型,flag-NS1变异型质粒,分别用两种质粒转染HEK293细胞,转染后16 h,感染SV 8 h,然后收集细胞,作Western印迹分析,用抗flag抗体鉴定野生型和变异型NS1的表达,用抗IRF-3抗体观测NS1对SV活化IRF-3的抑制作用,用荧光素酶功能分析的方法观测两种NS1对SV诱导的干扰素β启动子-pGL-2B荧光素酶活性的影响.结果感染的5种病毒中仅毒性较低的A/HK/1/68-MA20和阳性对照SV能使IRF-3磷酸化,感染MA20后9 h开始有IRF-3磷酸化,23 h和26 h最强,比较A/HK/1/68和A/HK/1/68-MA20的NS1序列,发现从cDNA起始的第94位核苷酸由T变成C,蛋白质的第23位由缬氨酸变成丙氨酸.NS1野生型和变异型均有高表达.结论 A/HK/1/68-MA20的NS1的点变异可导致失去野生型NS1的抑制干扰素β启动子活性的作用.     

RNA干扰作为一种病毒性肝炎治疗手段的可能性（下）

若干研究已经探究了使用RNAi作为一种潜在的抗HCV感染干预治疗的可能性。作为正义的单链RNA病毒，通过负义的复制中间体提供了该技术的可能性，至少在理论上，RNAi能够清除来自受染细胞的病毒基因组、复制形式和mRNA种类并由此消除HCV感染。然而，在HCV复制的培养中缺乏适合的系统，使证明siRNA抑制病毒复制子RNA的复制可能性的研究受到了限制。在若干研究中已经证明了在NS3和NSSBORFs中siRNA对抗不同位点的作用。通过定量RT～PCR证明了在隐匿HCV复制子的细朐中HCV转录水平有21-23倍的降低。     

商陆抗病毒蛋白对感染细胞模型中HCV复制的影响

目的：探讨商陆抗病毒蛋白（PAP）对丙型肝炎病毒（HCV）感染细胞模型中HCV复制的影响。方法：用不同浓度PAP处理HCV感染细胞模型（HCV-HepG2），以荧光定量PCR法检测培养上清液中及细胞内HCV RNA，以不同浓度的α-2b干扰素（IFNα-2b）处理同样的细胞模型作为对照。结果：经PAP处理后各模型组细胞内HCV RNA含量于48小时、96小时和144小时进行比较，差异有非常显著性意义（P〈0．01）；培养上清液中HCV RNA含量在48小时时，各组间比较，差异无显著性意义（P〉0．05），但在96小时和144小时时，各组间比较差异有非常显著性意义（P〈0．01）。PAP对HCV的抑制作用随PAP浓度的增加而增强，以100μg／ml浓度的抑制作用最强。用IFN-α2b处理HCV—HepG2模型亦得出类似的结果。两者均以第48小时的抑制率最高。但在96小时、144小时时PAP对细胞内HCV的抑制作用明显强于IFN（P〈0．05，P〈0．01）。结论：PAP对HCV感染细胞模型中的HCV复制有明显地抑制作用，且作用强于IFN-α2b。PAP对细胞无明显毒性。     

携带IFN—β基因的丙型肝炎病毒微型基因组构建及抑制病毒复制的效应

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）反应性干扰素（IFN）-β的微型基因组及其抑制效应的初步评价。方法提取poly I：C刺激的淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增IFN-β基因,克隆入前期构建的HCV微型基因组pT7-5U△131-315rI3Urz;PCR并鉴定插入方向,将反向插入的质粒命名为pT7-5U△131-315rIFNI3Urz。将微型基因组5U△131-315rIFNI3URz克隆入pcDNA3.1载体,获得pCMV-5U△131-315rIFNI3URz。将体外转录的5U△131-315rIFNI3URz RNA转染Huh7.5BB7细胞,48 h后检测IFN-β的表达。将pCMV-5U△131-315rIFNI3URz转染Huh7.5 JFH-1细胞系,荧光实时定量PCR法测定细胞中HCV RNA。结果成功建立了Huh7.5JFH-1细胞系;含有IFN-β的微型基因组在复制子细胞和HCV感染细胞中可以特异表达IFN-β;携带IFN-β的HCV微型基因组可以降低细胞中病毒的RNA拷贝水平,具有一定的剂量依赖效应。结论反向插入IFN-β基因的HCV微型基因组进入HCV感染细胞内表达IFN-β并靶向抑制病毒的复制,为抗HCV感染研究提供了一个新的方法和思路。     

干扰素诱导的TRIM22通过泛素化降解NS5A来抑制HCV

正【据《Cell Mol Immunol》2016年1月报道】题:干扰素诱导的TRIM22通过泛素化降解NS5A来抑制HCV(作者Yang C等)TRIM22是一种三模序蛋白,HCV感染的患者经过IFNα治疗之后,在外周血单个核细胞中可以观察到TRIM22的上调。但是这个表达水平的上调究竟有什么生理学意义目前尚不清楚。来自上海生物科学研究所的Yang C等阐述了TRIM22通过降解NS5A而产生抗HCV的作用。NS5A是HCV一个重要的非结构蛋白,之前的     

多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的研究

目的探讨多抗原肽（MAP）免疫兔血清体外阻断丙型肝炎病毒（HCV）感染人外周血单个核细胞。方法用兔抗MAP血清按一定比例混合后接种于HCV感染的人外周血单个核细胞,采用逆转录聚合酶链反应、免疫组化和原位杂交技术分别检测细胞内或上清中HCV RNA、细胞内HCV NS3和HCV NS5抗原的表达。结果兔抗MAP血清按1：1混合后,外周血单个核细胞仍可检出HCV RNA,细胞有HCV NS3抗原表达;而按5：1和10：1混合后,单个核细胞内未检测出HCV正负链RNA,未见特异性抗原表达,原位杂交也未检测出HCV RNA存在。结论兔抗MAP血清在体外能部分阻断HCV感染。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A对干扰素α-2b诱导的信号传导和转录激活因子1磷酸化及核转移的影响

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对干扰素α-2b诱导的Janus激酶-信号传导和转录激活子（JAK—STAT）信号传导途径中STAT1磷酸化及核转移的影响。方法用表达HCVNS5A的质粒（pCNS5A）转染Huh7细胞，应用免疫细胞化学技术检测HCVNS5A的表达，用免疫荧光和Western blot方法检测HCVNS5A对干扰素α-2b诱导的STAT1磷酸化和核转移的影响。结果转染了pCNS5A的Huh7细胞质可见HCVNS5A蛋白的表达；以干扰素α-2b诱导30min后，STAT1磷酸化及核转移在转染了表达HCVNS5A的质粒组比转染空白载体pRC／CMV组及未转染组减少，而未转染组及转染空白载体pRC／CMV组间无明显差别。结论表达HCVNS5A的质粒pCNS5A成功转染至Huh7细胞；HCV NS5A减弱干扰素α-2b诱导的STAT1的磷酸化及核转移，提示NS5A影响干扰素α-2b的JAKSTAT信号传导途径可能是HCV干扰素抵抗的机制之一。     

丙型肝炎病毒NS5A基因在自然感染过程中的准种动态

干扰素敏感决定区（ISDR）的准种特性与干扰素的疗效密切相关。体外研究发现，野生型的丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）能与干扰素（内源或外源的）诱导的双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）结合并相互作用，从而抑制PKR的抗病毒活性。部分揭示了NS5A与HCV持续感染的关系。为了进一步调查ISDR，PKR-BD，V3和NS5A其他功能区的变异情况，本研究从7例慢性丙型肝炎患者10年前与10年后血清中扩增并克隆NS5A基因，进行序列分析发现，野生型干扰素敏感决定区毒株在所有感染者中具有选择优势。     

慢性丙肝患者血清干扰素抗体检测及其临床意义

选择94例慢性丙型病毒性肝炎(慢性丙肝)患者，采用α2b—干扰素(α2b—IFN)治疗，动态检测其血清抗—HCV、HCV—RNA及α2b—IFN—IgG表达水平。结果显示α2b—IFN治疗后抗—HCV、HCV—RNA阴转率分别为32．98％(31／94)和38．30％(36／94)，常规治疗组治疗后抗—HCV、HCV—RNA阴转率分别为10．OO％(4／40)和15．OO％(6／40)，两者相比差异有显著性(P＜O．01)。α2b—IFN治疗后抗—IFN—IgG阳检率为5．32％(5／94)，与常规治疗组相比差异无显著性(P＞O．05)。认为α2b—IFN对抗—HCV、HCV—RNA阴转具有肯定疗效，且优于常规治疗，是治疗慢性丙肝的有效药物之一。α2b—IFN虽有一定的免疫原性，但在治疗过程中仅诱导机体产生低水平的抗α2b—IFN—IgG，对IFN—α2b的抑制作用较弱。     

丙型肝炎病毒体外感染肝癌细胞株HepG2的初步研究

目的 研究人肝癌细胞株HepG2对丙型肝炎病毒（HCV）的易感性，建立细胞感染模型。方法 将人肝癌细胞株HepG2与慢性丙型肝炎患者血清共同温育6-8h，收集不同时相点标本，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR)法分别检测细胞内或上清液中正负链RNA，免疫组织化学法检测细胞内HCV NS3，NS5特异性抗原的表达情况，以及原位杂交法检测细胞内HCV负链RNA。结果 接种感染血清3-35d，可在细胞内或培养上清液中检出HCV正负链RNA；HCVNS3，NS5特异性抗原能在感染细胞内稳定表达，阳性物质位于胞浆中；原位杂交法证实细胞内存在负链RNA，也位于胞浆中，结论 人肝癌细胞株HepG2不但对HCV易感，而且可以稳定地支持HCV体外复制。     

HCV NS5B在人肝癌细胞系Huh7细胞内的表达及活性分析

目的为靶向抗HCV药物筛选奠定基础。方法使用脂质体将包含HCV非结构蛋白5B（NS5B）基因的重组载体pcDNA-5B转染至人肝癌细胞系Huh7细胞,分别采用RT-PCR和Western Blot鉴定NS5B mRNA和蛋白表达,采用荧光素酶试验检测NS5B细胞内RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）活性。结果转染的Huh7细胞出现1．8kb的特异性NSSB mRNA目的带及一条相对分子质量约66kD的蛋白目的带,且后者具有细胞内RdRp活性。结论人肝癌细胞系Huh7细胞可成功表达具有细胞内RdRp活性的NS5B,以其为靶标的抗HCV药物可为临床治疗提供新思路。     

基因1型丙型肝炎抗病毒药物的初步研究

对聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗没有反应的慢性丙型肝炎的患者,可能从增加多个直接作用的抗病毒药物治疗方案中受益。这种开放式模式,第2a期研究包括探索对以前治疗没有反应的1型慢性HCV的2l例患者(即,应用聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合治疗≥12周后HCV RNA下降小于2log₁₀的患者)。我们随机分配患者接受NS5A复制复合体抑制剂daclatasvir（60mg,每天1次）和NS3蛋白酶抑制剂asunaprevir的（600 mg,每天2次）单独组（A组,11例）或联合聚乙二醇干扰素α-2a和利巴     

丙型肝炎病毒NS5A在肝癌细胞对TLR4表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A（HCV NS5A）对Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法用含HCV NS5A基因的表达质粒pcNS5A瞬时转染QSG7701细胞,采用免疫细胞化学技术检测HCV NS5A及TLR4蛋白质的表达;采用逆转录聚合酶链反应观察HCV NS5A和TLR4的mRNA表达。结果转染pcNS5A质粒细胞内有HCV NS5A蛋白的表达。转染pcNS5A组TLR4 mRNA及蛋白质表达均较转染pRc/CMV和未转染质粒组明显增强,而后两组细胞TLR4 mRNA和蛋白质表达相似。结论 HCV NS5A可上调TLR4 mRNA和蛋白的表达。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A基因酵母表达载体的构建及表达

丙型肝炎病毒（HCV）是一种单股正链RNA病毒，在HCV丝氨酸蛋白酶和宿主细胞信号肽酶的联合作用下，裂解成为10余种结构和非结构蛋白。其中，HCV NS4A蛋白作为一种非结构蛋白形式，是NS3丝氨酸蛋白酶裂解活性的辅因子，并参与NSSA蛋白磷酸化修饰和免疫应答的调节。为了进一步研究NS4A蛋白在肝细胞内的功能，我们在酵母细胞中表达了NS4A蛋白。     

丙型肝炎病毒体外感染胎肝细胞的初步研究

目的：探索原代培养胎肝细胞对丙型肝炎病毒（HCV）的易感性,旨在建立较为稳定实用的细胞感染模型。方法：研究血清与培养肝细胞共同孵育6－8h后,收集不同时相点标本,用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）分别检测细胞内或上清液中正负链RNA,免疫组化检测细胞内HCV NS3,NS5特异性抗原的表达情况,以及原位杂交检测细胞内HCV负链RNA。结果：接种感染血清3d后,即可在细胞内或培养上清液中检出HCV正负链RNA,间断检出至感染后第17天,HCV NS3,NS5特异性抗原可在感染细胞内表达,阳性物质位于乐中,原位杂交法证实细胞内存在负链RNA,也位于胞浆中,结论：原代培养的胎肝细胞对HCV不但易感,而且稳定地支持HCV复制。     

HCV NS5A反式激活基因NS5ATP13对肝癌细胞生长的影响

目的验证HCV NS5A对NS5ATP13基因反式激活作用,并检测NS5ATP13基因表达产物对Huh-7细胞系生长的影响。方法应用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法验证HCV NS5A对NS5ATP13基因的反式激活作用,构建NS5ATP13与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白表达载体,用荧光显微镜观察NS5ATP13-GFP融合蛋白在细胞的分布。结果 HCV NS5A可反式激活NS5ATP13基因的表达,NS5ATP13-GFP融合蛋白荧光主要集中在细胞核质,转染细胞出现大量双核及多核现象,活细胞发光法检测NS5ATP13具有促进细胞增殖的作用。结论 NS5ATP13基因生物学功能的研究,为HCV致肝纤维化和肝癌的病理机制研究提供新的思路。     

在血清缺乏丙型肝炎病毒RNA的慢性丙型肝炎病人的外周血单个核细胞中检测出丙型肝炎病毒序列

丙型肝炎病毒(HCV)在HCV感染病人的外周血单个核细胞(PBMC)中可以复制。对于血清HCV RNA阴性,抗-HCV阳性,组织学证明为慢性肝炎的病人,用PBMC检测HCV RNA的数据很少。对这样的20位患者进行了研究,其中11位在干扰素α(IFN)治疗其间血清HCV RNA阴性,ALT(转氨酶)正常,只发现一例PBMC中HCV序列阳性。