嗜线虫致病杆菌YL001抑菌活性成分及其产量影响因素的研究

采用硅胶柱层析等分离方法,结合MS与NMR技术,对嗜线虫致病杆菌YL001发酵产物中的抑菌活性成分进行分离鉴定;采用微量稀释法对Nematophin的抑菌活性进行测定;利用HLPC分析不同因素对Nematophin产生的影响。结果表明,分离得到主要抑菌活性物质Nematophin,并鉴定其结构为3-吲哚乙基(3′-甲基-2′-酮)戊酰胺,其对革兰氏阳性菌具有较好的抑菌活性;不同菌株发酵产物中Nematophin的产量不同,其中YL001菌株的产量最高,为115.23μg/mL;Nematophin产量在初始pH 4.5~8.5逐渐升高,初始pH 8.5时最高,为155.08μg/mL。发酵罐培养条件下Nematophin的产量高于摇瓶,且在初始pH 8.5时达到最高,为206.97μg/mL。主要抑菌活性物质与文献报道的Nematophin相同,昆虫病原线虫共生菌次生代谢物的产生与菌种、菌株及培养条件密切相关。     

渗透压对嗜线虫致病杆菌YL001生长及抑菌活性的影响

【目的】研究渗透压对嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001菌体生长、抑菌活性的影响,为进一步提高YL001抑菌活性及开发利用奠定基础。【方法】以NaCl为渗透压调节剂,分别测定其质量浓度为0,5,10,20,30和40g/L条件下,嗜线虫致病杆菌YL001不同时间段细胞生长量、pH、还原糖变化;采用琼脂扩散法、生长速率法及活体组织法测定了YL001发酵液的抑菌活性;同时采用HPLC及LC-MS分析了甲醇提取物中酰胺类化合物(Nematophin)与水溶性苯并芘类化合物(Xenocoumacins,包括XCN1和XCN2)含量差异。【结果】在NaCl质量浓度为0,5g/L时,YL001细胞生长最适且无显著差异,吸光值分别达0.63,0.62,随着NaCl质量浓度的进一步增大细胞生长量显著下降;在NaCl质量浓度为0,5,10g/L时,YL001发酵液对苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、猕猴桃溃疡病菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用较好且无显著差异,随着NaCl质量浓度的进一步增大抑菌作用显著降低;在NaCl质量浓度为0,5g/L时,YL001发酵液对水稻稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、苹果树腐烂病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌的抑制率均高于80%且均无显著差异,明显优于其他较高NaCl质量浓度的处理;在NaCl质量浓度为0,5,10g/L时,YL001发酵液对番茄灰霉病的治疗作用较好且无显著差异,在NaCl质量浓度为0,5g/L时,对番茄灰霉病的保护作用较好且无显著差异,治疗作用和保护作用均随着NaCl质量浓度的进一步增大而显著下降;甲醇提取物中抑菌活性物质Nematophin含量、XCN1的相对含量随NaCl质量浓度的增大显著下降,如NaCl质量浓度为0g/L时,甲醇提取物中抑菌活性物质Nematophin含量、XCN1的相对含量较NaCl质量浓度为40g/L时分别提高7.82和27.55倍;XCN2的相对含量在NaCl质量浓度为5g/L时最高,显著高于其他处理。【结论】低渗透压有利于X.nematophila YL001菌体生长、抑菌活性提高及抑菌活性代谢产物Nematophin、Xenocoumacins的产生。     

恒定pH对Xenorhabdus nematophila YL001抑菌活性及抑菌物质合成相关基因表达的影响

为明确恒定pH对Xenorhabdus nematophila YL001抑菌物质产生及相关抑菌物质合成的影响,对pH 5.5、pH 7.0及pH 8.5培养条件下X.nematophila YL001的抑菌活性、主要抑菌物质[Xenocoumacin1(XCN1)和Nematophin]的代谢差异及主要抑菌物质的生物合成基因与相关转录调节子基因的表达量进行分析。结果表明,X.nematophila YL001发酵液对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑菌作用在pH 7.0时最佳,而其胞外产物乙酸乙酯与甲醇提取物对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑菌作用在pH 8.5时最佳;LC-MS分析表明,随pH的升高,活性物质xcn1的相对含量逐渐升高,而Nematophin的相对含量则先升高后下降;qRT-PCR分析表明,不同恒定pH下,X.nematophila YL001主要抑菌物质生物合成基因及相关转录调节子基因的表达量存在显著差异。pH可显著影响X.nematophila YL001菌株的抑菌活性及代谢,且碱性条件更利于活性物质的产生并保持稳定性。     

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。     

嗜线虫致病杆菌Sy1a菌株粗提液杀虫活性的研究

以桃蚜(Myzus persicae),豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum Harris)和白粉虱(Trialeurodes?vaporariorum)作为供试昆虫,对Sy1a菌株粗提液的杀虫活性和总蛋白酶活性进行测定。结果表明:桃蚜取食浓度分别为400、600、1 000μg/ml Sy1a菌株粗提液48 h后LC50值为987.7μg/ml,IC50值为5 941.2μg/ml;豌豆蚜取食浓度分别为250、500、1 000μg/ml Sy1a菌株粗提液36 h后,LC50值为227.2μg/ml,IC50值为508.3μg/ml;采用浓度为1 200.0μg/ml的Sy1a菌株粗提液处理后7、14和21 d的温室中白粉虱虫口减退率分别为51.6%、83.7%、89.1%,校正防效分别达到62.0%、88.7%、93.1%。研究结果表明:Sy1a菌株粗提液对桃蚜、豌豆蚜及白粉虱等害虫均有显著的防治效果,具有开发成为环境友好型生物农药的前景。     

嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

 【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种（Xenorhabdus nematophila var. pekingensis）CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白，鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose FF离子交换柱层析、Butyl Sepharose FF疏水柱层析和Sephacryl S-200 HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化，采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58 μg•ml-1含量E1、以4.21 μg•ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫，对幼虫的生长抑制率分别达62.63％和97.9％。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似，经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212 kD，该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种（类）蛋白。     

致病杆菌属CB43菌株代谢物抑菌活性及理化性质

CB43菌株是中国农业科学院环境与可持续发展研究所从采自中国东北地区的昆虫病原线虫新种拟双角斯氏线虫（Steinernema ceratophorum）肠道内分离的菌株,用CB43菌株发酵液对灰葡萄孢进行了平板抑菌活性测定和防治番茄灰霉病盆栽试验,并对CB43菌株抗菌物质的理化性质进行了测定．结果表明,CB43菌株产生的抗菌物质对灰霉病菌菌丝有较强的抑制作用,125mL/L发酵液能完全抑制菌丝的生长,62．5mL/L的发酵液72h后菌丝抑制率仍达83．35％;盆栽防治灰霉病效果达67．3％,CB43代谢物的理化特性表明,抗菌物质为极性,两性化合物,在酸性和碱性及高、低温条件下均较稳定。     

嗜线虫致病杆菌代谢物对马铃薯晚疫病菌的抑制作用

报道了嗜线虫致病杆菌发酵液对马铃薯晚疫病的平板抑制作用以及对离体叶片和盆载植株的防病效果。嗜线虫致病杆菌发酵液对致病疫霉菌丝生长有强烈的抑制作用 ,5 0～ 12mL·L-1发酵液能完全抑制疫霉菌丝的生长 ;10 0～ 5 0mL·L-1发酵液对离体马铃薯叶片晚疫病的发病和病害发展有较强的控制作用 ,其病害控制率分别达 10 0 %和 93.0 8% ;在盆载试验中 ,5 0mL·L-1的发酵液作为保护剂对晚疫病害控制率平均达 75 .9% ,与 2 0mL·L-1的 2 5 %甲霜灵效果差异不显著 (P =0 .0 5 ) ,作为治疗剂对病害的控制率达 5 2 .4% ,当低剂量的甲霜灵与发酵液混合时 ,其防病效果相当于二者单独使用的效果 ,说明发酵液与甲霜灵之间有增效作用。     

渗透压对嗜线虫致病杆菌YL001生长及抑菌活性物质产生的影响

【目的】研究渗透压对嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophila）YL001菌体生长、抑菌活性及抑菌活性物质产生的影响,为进一步提高YL001抑菌活性及开发利用奠定基础。【方法】以NaCl为渗透压调节剂,分别测定NaCl质量浓度为0,5,10,20,30和40 g/L条件下,X.nematophila YL001不同时间段细胞生长量、pH、还原糖变化;采用琼脂扩散法、生长速率法及活体组织法测定了YL001发酵液的抑菌活性;同时采用HPLC及LC-MS分析了甲醇提取物中酰胺类化合物（Nematophin）与水溶性苯并芘类化合物（Xenocoumacins,包括XCN1和XCN2)含量差异。【结果】在NaCl质量浓度为0,5 g/L时,YL001细胞生长最适且无显著差异,吸光值分别达0.63,0.62,随着NaCl质量浓度的进一步增大细胞生长量显著下降;在NaCl质量浓度为0,5,10 g/L时,YL001发酵液对苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、猕猴桃溃疡病菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用较好且无显著差异,随着NaCl质量浓度的进一步增大抑菌作用显著降低;在NaCl质量浓度为0,5 g/L时,YL001发酵液对水稻稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、苹果树腐烂病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌的抑制率均高于80%且均无显著差异,明显优于其他较高NaCl质量浓度的处理;在NaCl质量浓度为0,5,10 g/L时,YL001发酵液对番茄灰霉病的治疗作用较好且无显著差异,在NaCl质量浓度为0,5 g/L时,对番茄灰霉病的保护作用较好且无显著差异,治疗作用和保护作用均随着NaCl质量浓度的进一步增大而显著下降;甲醇提取物中抑菌活性物质Nematophin含量、XCN1的相对含量随NaCl质量浓度的增大显著下降,如NaCl质量浓度为0 g/L时,甲醇提取物中抑菌活性物质Nematophin含量、XCN1的相对含量较NaCl质量浓度为40 g/L时分别提高7.82和27.55倍;XCN2的相对含量在NaCl质量浓度为5 g/L时最高,显著高于其他处理。【结论】低渗透压时有利于X.nematophila YL001菌体生长、抑菌活性提高及抑菌活性代谢产物Nematophin、Xenocoumacins的产生。     

嗜线虫致病杆菌杀虫毒素对棉铃虫的中肠组织病理学研究

 嗜线虫致病杆菌HB310菌株与小卷蛾斯氏线虫HB310共生，对多种昆虫均具有较高生物活性。本实验通过盐析和非变性凝胶电泳等方法从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化出具胃毒活性的蛋白毒素Ⅱ。经毒素Ⅱ处理的棉铃虫幼虫，中肠组织的病理学变化类似于发光杆菌Tca毒素和Btδ-内毒素。棉铃虫4龄幼虫口服毒素Ⅱ 6 h后中肠组织开始发生变化：首先围食膜前端破碎，中肠柱状细胞伸长；随着时间推移，12 h后整个围食膜被破坏消失，中肠组织病变加重，肠壁细胞排列疏松混乱；随着毒素作用的逐渐减弱，处理72 h后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。毒素Ⅱ离体处理棉铃虫围食膜，同样可以导致围食膜破碎。     

昆虫病原线虫共生菌YL001菌毛蛋白亚基基因的克隆与序列分析

为了准确克隆昆虫病原线虫共生菌YL001菌毛蛋白亚基基因,根据已报道的菌毛蛋白亚基序列设计引物,以昆虫病原线虫共生菌YL001的总DNA为模板进行PCR扩增,获得1条大约500 bp的特异性片断,将此片断克隆到T-easy载体上,获得了重组子pGEM-PSYL001,序列测定和结构分析结果表明,PSYL001阅读框全长537bp,编码179个氨基酸,预测分子量和等电点分别为18.9 ku和6.94,GenBank登录号为DQ537944。与GenBank(AY140909)上公布的Xenorhabdus nematophilus菌毛蛋白亚基核苷酸序列的同源性为99%,氨基酸序列的同源性为98%。上述分析表明,菌毛蛋白亚基基因得到了成功克隆。     

半红树林植物黄槿内生真菌多样性及其抗菌活性研究

黄槿植物的叶、树皮和花是中药黄槿的入药部位,具有抗菌、抗炎、抗肿瘤的药用价值。药用植物内生真菌与宿主植物在基因层面存在信息传递,会产生与宿主植物相同或相似的代谢产物,因此黄槿内生真菌次生代谢产物可能成为新型天然活性产物。从不同地点采集的半红树林植物黄槿中分离纯化出64株内生真菌并鉴定,通过固体发酵得到其次生代谢产物,采用牛津杯法检测内生真菌的粗提物对5种常见致病细菌的抑菌活性,后根据分离部位的不同构建系统发育树,并筛选确定3株具有强抑菌活性的菌株,用于后续次生代谢产物中化学成分的研究。     

pH对桑黄 TH021菌株液体发酵抗氧化能力的影响

【目的】探索pH对桑黄TH021菌株液体发酵及其甲醇提取物抗氧化能力和主要活性成分的影响,为充分利用该菌提供依据。【方法】用5L机械搅拌发酵罐在pH 4.5,5.5,6.5和7.5下进行桑黄TH021菌株液体发酵,于培养第8天时获取滤液、菌丝体,测定其生长速率,分析甲醇提取物对DPPH自由基清除能力、亚铁离子螯合作用、超氧阴离子清除作用及主要活性成分含量,研究pH对桑黄TH021液体发酵甲醇提取物抗氧化能力及活性成分的影响。【结果】桑黄TH021菌株生长的最适pH值为6.5。在pH为6.5时,桑黄TH021菌株滤液甲醇提取物产量(LYC)达到最高,为(4.63±0.01)g/L;桑黄TH021菌株液体发酵菌丝体甲醇提取物对DPPH、超氧阴离子的清除作用,以及滤液甲醇提取物对亚铁离子的螯合作用均达到最高;菌丝体甲醇提取物总酚含量和黄酮类物质含量均达到最高,分别为(14.04±1.69)和(9.21±1.14)mg/g。在pH为7.5时,桑黄TH021菌株液体发酵滤液甲醇提取物多糖含量达到最高,为(66.10±1.96)mg/g。【结论】pH对桑黄TH021菌株液体发酵甲醇提取物抗氧化能力及主要活性成分有显著影响,因此要在适宜的pH下使用。     

杜仲内生真菌中抗苹果炭疽病活性菌株的筛选

对杜仲植株中的内生真菌进行分离纯化,共得到32株内生菌株。通过离体平板对峙培养检测、光学显微镜观察,以及测定在活体果实上的拮抗活性,研究杜仲拮抗真菌与病原菌及其寄主植物苹果果实之间的相互作用。对峙培养显示杜仲内生真菌DZGS07对苹果炭疽菌有较强拮抗作用,具有较强的营养和空间竞争能力,显微观察表明其能造成病原菌菌丝畸形等现象。在生防研究中,内生真菌DZGS07对苹果炭疽病具有较好的生防潜力,处理后的第7天防效达84.19%;对该菌株的ITS 序列进行测定分析,初步鉴定DZGS07为炭疽菌属(Colletotrichum)的真菌。     

温度和pH对黄金鲈消化酶活力的影响

【目的】研究温度和pH对黄金鲈消化酶活力的影响。【方法】采用酶学分析方法,研究不同温度和pH对黄金鲈蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的影响。其中,蛋白酶采用福林-酚法测定,淀粉酶和脂肪酶分别采用淀粉酶试剂盒和脂肪酶试剂盒测定。【结果】在设定的温度和pH范围内,黄金鲈各组织器官消化酶的活力均随着温度和pH的升高呈先升高后下降的变化趋势。其中,胃和肝脏蛋白酶的最适温度为40℃,前肠、中肠和幽门盲囊蛋白酶的最适温度均为50℃;胃、中肠、肝脏淀粉酶的最适温度均为35℃,前肠和幽门盲囊的淀粉酶最适温度为30℃;各组织器官脂肪酶活力最适温度均为40℃。黄金鲈胃、幽门盲囊、前肠、中肠和肝脏蛋白酶的最适pH分别为2.5,8.0,9.0,9.0和6.0,淀粉酶的最适pH分别为6.0,6.0,7.0,7.0和6.0,脂肪酶的最适pH分别为6.0,7.0,7.0,7.0和7.0。黄金鲈不同组织器官的消化酶活力不同。在最适温度下,不同组织器官蛋白酶活力顺序为幽门盲囊前肠胃中肠肝脏,淀粉酶的活力顺序为肝脏前肠中肠幽门盲囊胃,脂肪酶的活力顺序为肝脏胃前肠幽门盲囊中肠。【结论】黄金鲈消化酶活力的最适温度均高于其生长的最适水温。胃蛋白酶在强酸性时活力较高,肝脏蛋白酶活力在偏酸性条件下较高,肠道和幽门盲囊蛋白酶活力在偏碱性时较高;淀粉酶活力在中性偏酸性时较高;脂肪酶在中性时活力较高。     

pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响

微菌核是棉花黄萎病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)在土壤中的主要存活形式及该病的侵染源,研究土壤pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响对明确黄萎病发生具有重要意义。采用菌丝生长速率法研究培养基pH及盐分质量浓度与种类对病原菌生长及微菌核形成的影响。供试大丽轮枝菌菌丝生长最适pH为7.0,偏酸或偏碱会抑制菌丝生长,但培养基偏碱可显著促进微菌核形成。当pH为8.0时,大丽轮枝菌菌丝生长受抑制较小,同时微菌核区面积较pH为7.0时增加22.6%。盐分质量浓度影响大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核形成。随培养基NaCl质量浓度增加,供试大丽轮枝菌生长受到抑制,菌落面积和菌丝面积均逐渐减小,但微菌核形成量却显著增加;当NaCl质量浓度为10g·L~(-1)时,微菌核区面积较无NaCl时增加40.7%。盐分种类影响供试大丽轮枝菌生长。随盐分质量浓度增加,氯化物(NaCl和KCl)和硫酸盐(Na_2SO_4和MgSO_4)均可促进大丽轮枝菌微菌核形成,而CaCl_2则显著促进菌丝生长,并在质量浓度大于7g·L~(-1)时抑制微菌核形成。在培养环境偏碱性或氯化物和硫酸盐含盐量较高时,均可促进棉花黄萎病原大丽轮枝菌微菌核形成量增加。     

1株野生蝉虫草的鉴定及其胞内和胞外多糖抗肝癌活性比较

【目的】对1株野外采集的蝉虫草进行分离和鉴定,分析比较其发酵菌丝体胞内和胞外多糖的抗肝癌细胞HepG-2活性及多糖的组成。【方法】通过形态学特征和ITS序列分析,对供试菌株进行鉴定;采用MTT法、细胞划痕试验,比较供试菌株菌丝体胞内和胞外多糖对人肝癌细胞HepG-2的抑制活性以及对人正常肝细胞LO2的毒性,并通过高效液相色谱法和凝胶渗透色谱法,比较分析2种多糖的成分及分子质量分布。【结果】根据菌株形态学特征和ITS序列分析,供试菌株为蝉虫草Cordyceps cicadae;其胞内和胞外多糖均可极显著抑制HepG-2细胞活性（P<0.01）,半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为3.23和0.45 mg/mL,细胞迁移率分别为38.72%和24.79%,提示胞外多糖比胞内多糖具有更强的抗肝癌细胞HepG-2活性;且2种多糖对人LO2细胞均无明显毒性;进一步分析发现,胞外多糖中半乳糖醛酸的含量是胞内多糖的23.53倍,其分子质量的94.1%集中在19.1～85.0 ku,胞内多糖中核糖是其特征性单糖,高分子质量多糖（>250.0 ku）分布占比明显高于胞外多糖。【结论】野生蝉虫草菌株发酵所产胞外多糖的抗肝癌细胞HepG-2活性较胞内多糖强,二者在单糖组成和分子质量分布上存在明显差异。