呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化Toll样受体7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化及其介导所产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用。方法 48只BALB/c鼠,随机分为正常对照组、RSV感染组、咪喹莫特干预组。以RSV活病毒滴鼻感染BALB/c鼠,诱导急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特处理,分别于感染后4、8、12和24 h不同时间点,用半定量RT-PCR法检测鼠肺TLR7、IFN-α/β、RSV融合蛋白(RSV F蛋白)的mRNA表达,HE染色观察肺的病理学改变。结果①RSV感染早期,TLR7、IFN-α/β、RSV F蛋白的mRNA表达均升高,并与RSV感染之间存在时间依赖性关系;肺的炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度与RSV感染时间相关;②咪喹莫特干预组预先给予TLR7激动剂咪喹莫特处理后,再行相同RSV感染,TLR7、IFN-α/β的mRNA表达量进一步升高,但RSV F蛋白的mR-NA表达下降;肺的炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻。结论 RSV感染可活化上调BALB/c鼠肺组织中TLR7表达,其表达量与感染之间存在时间依赖关系;其介导产生的Ⅰ型IFN起着抗病毒作用,在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,使肺部炎症减轻。     

Toll样受体在视网膜缺血小胶质细胞激活过程中的作用

Toll样受体(TLRs)是模式识别受体的一类,其能够特异性识别病原体相关模式分子,激活TLRs通路,分泌促炎性细胞因子,从而引起神经细胞的变性损伤。视网膜缺血性损伤是多因素综合作用的结果,而近年的研究越来越重视激活的小胶质细胞在视网膜缺血损伤中的作用,激活的小胶质细胞通过TLRs介导炎症信号通路,诱导神经损伤,形成视网膜慢性炎症环境。而视网膜慢性炎症环境是糖尿病视网膜病变、青光眼等视网膜缺血性疾病的共同病理过程。未来可通过对TLRs所介导信号通路的深入研究,探寻潜在的治疗手段去抑制TLRs介导的炎症信号通路和小胶质细胞激活,从而减轻视网膜缺血性损伤的病理改变。     

TOLL样受体TRIF信号因子与RSV关系的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿急性下呼吸道感染最常见和最重要的病毒病原,尤其是肺炎和毛细支气管炎。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是近年来发现在抗感染及免疫反应起到重要作用的受体蛋白,可广泛识别多种病原微生物的病原分子相关模式(Pathogen Molecular Associated Pattern,PMAP)。机体可通过TLRs识别病毒成分介导细胞因子分泌,激活效应免疫细胞以抵抗病毒病原体入侵。其中TLR3、TLR4信号通路与其关系最为密切,而含TIR结构域诱导β干扰素的接头蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)作为两者的共同重要衔接分子,在信号途径中发挥着关键的作用,通过调控细胞因子的分泌影响适应性免疫应答。     

Toll样受体在介导危重型手足口病炎性反应中的作用

【摘要】 目的 研究Toll样受体在介导危重型手足口病（HFMD）炎性反应中的作用。方法 选择2016年07月~2017年03月收治的47例危重型手足口病患儿（危重型组）为研究对象,另选取同期感染科收治30例普通型HFMD作为疾病对照组,门诊健康体检30例儿童为健康对照组,采集外周静脉血,分离单个核细胞（PBMCs）,测定TLR2、3、4、7、8、9水平及血清TNF α、IFN γ、IL 6水平。结果 三组受试者PBMCs中TLR3、TLR4、TLR7和TLR8 mRNA表达水平差异有统计学意义（P<005）,TLR2和TLR9 mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞005）。其中危重型手足口病组PBMCs中TLR3、TLR4、TLR7和TLR8 mRNA表达水平显著高于其他两组,健康对照组最低（P<005）。三组受试者血清中TNF α、IFN γ、IL 6表达水平有显著性差异;危重型手足口病患儿血清中TNF α、IFN γ、IL 6表达水平显著高于其他两组,健康对照组最低（P<005）。Pearson相关性分析显示,PBMCs中TLR3、TLR4、TLR7和TLR8 mRNA水平与血清中TNF α、IFN γ、IL 6水平呈正相关（P<005）。结论 危重型手足口病TLR3、TLR4、TLR7和TLR8表达明显增高,进而激活相关信号通路,介导机体的炎性反应。     

Toll样受体4活化增强乳腺癌细胞株MCF-7侵袭力的研究

目的:研究Toll样受体4(TLR4)在人类乳腺癌MCF-7细胞株中的表达及在肿瘤增殖和转移中的作用?方法:脂多糖(LPS) 刺激MCF-7细胞株,RT-PCR?Real-time PCR?FCS 和 Western blotting 检测TLR4在mRNA和蛋白水平表达变化;MTT检测细胞增殖;RT-PCR 和 real-time PCR检测基质金属蛋白酶(MMP-2)?MMP-9 和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达并用ELISA检测培养上清中其蛋白表达水平;Western blot检测TLR4信号传导通路下游蛋白MyD88的表达;CBA测定细胞培养上清的炎性细胞因子;划痕实验检测癌细胞的生物学侵袭力?结果:实验表明,LPS刺激MCF-7细胞株能明显上调TLR4 mRNA和蛋白表达(P < 0.05)?MTT结果显示,LPS对癌细胞增殖没有影响?LPS激活TLR4后,MMP-2?MMP-9和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达均明显上调 (P < 0.05)?划痕实验表明,LPS能显著增强MCF-7细胞株的划痕愈合能力?此外,LPS能诱导TLR4信号通路下游MyD88蛋白表达的显著上调(P < 0.05),IL-6的分泌增多(P < 0.05)?结论:LPS能明显增强MCF-7细胞株TLR4的表达,增强癌细胞的侵袭力?     

呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化TLR7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化,初步研究TLR7活化在RSV感染中介导产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用及其可能的调控机制。方法以RSV滴鼻感染BALB/c鼠建立急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特(Imiquimod)处理,分别于感染后4、8、12、24 h不同时间点处死小鼠取肺组织,并以未感染病毒的BALB/c鼠为正常对照组。①HE染色观察肺的病理学改变;②用TRIzol提取肺组织总RNA,RT-PCR法检测鼠肺内TLR7、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素调节因子7(IRF7),干扰素α(IFN-α),干扰素β(IFN-β)及RSV融合蛋白基因(F基因)mRNA的表达;③Western blot法检测鼠肺组织TLR7蛋白的表达变化;④空斑形成实验(PFU)测定各组不同时间点肺组织匀浆中RSV滴度。结果①HE染色显示肺部炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度随感染时间延长而加重,经Imiquimod干预后肺部炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻;②在mRNA转录水平,RSV感染早期,感染组上调TLR7、IRF3/7、IFN-α/β、RSV F基因的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imi-quimod处理组,TLR7、IRF7、IFN-α的mRNA比感染组相同时间点的表达量明显升高,且升高有显著性差异,而IRF3、IFN-β表达量在Imiquimod干预后与RSV感染组相比升高不明显;而RSV F基因的mRNA表达量较RSV感染组明显下降;③在蛋白水平,RSV感染组上调TLR7蛋白的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imiquimod处理组,TLR7蛋白表达量较感染组显著升高;④RSV感染BALB/c鼠肺后,肺组织匀浆中RSV滴度随感染时间的延长而增加;给予TLR7激动剂Imiquimod处理组,RSV复制滴度水平较感染组明显减少。结论 RSV感染BALB/c鼠后通过活化TLR7,诱导Ⅰ型IFN的产生。用Imiquimod激动TLR7后,Ⅰ型IFN表达量较RSV感染组明显升高,RSV F基因和肺组织匀浆中RSV滴度水平明显减少,以及肺部炎症减轻,表明RSV引起的抗病毒免疫机制与TLR7活化的转导途径有关;而且激动TLR7后,IRF7和IFN-α的表达较IRF3和IFN-β明显升高,表明了IFN-α可能是主要通过IRF7通路由TLR7诱导产生的最主要Ⅰ型IFN。     

系统性红斑狼疮病人外周血浆细胞样树突状细胞中Toll样受体7的表达及其意义

目的:检测系统性红斑狼疮（SLE）病人外周血中浆细胞样树突状细胞（pDC）中Toll样受体7（TLR7）的表达,探讨其意义。方法:选取SLE病人52例（SLE组）和正常健康人28名（对照组）,利用流式细胞术检测外周血TLR7+的pDC细胞在各组中的比例。结果:SLE病人外周血单核细胞（PBMC）中pDC相对计数显著低于对照组（P<0.01）,SLE组和正常对照组髓样树突状细胞水平差异无统计学意义（P>0.05）。感染组SLE病人外周血pDC水平显著低于非感染组（P<0.01）,初发组SLE病人外周血髓样树突状细胞水平低于复发组（P<0.05）,pDC水平与外周血CRP呈负相关关系（P<0.05）。SLE病人外周血PBMC内pDC中TLR7+细胞的比例显著高于对照组（P<0.01）。血液系统受累组pDC内TLR7+细胞比例高于无血液系统受累组（P<0.05）。TLR7+pDC细胞比例在抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体阳性组及阴性组之间差异均无统计学意义（P>0.05）;TLR7+pDC细胞比例和蛋白尿分级呈显著正相关关系（P<0.01）。结论:SLE病人外周血TLR7+的pDC细胞比例显著升高,且与临床病情活动性有一定的相关性。     

Toll样受体通过炎性反应和免疫反应介导心肌纤维化的研究进展

Toll样受体(TLRs)是一类介导固有免疫反应,具有Ⅰ型跨膜蛋白并能识别大量外源性配体的重要受体。TLRs不仅能够抵抗病原微生物的入侵,而且在心肌缺血再灌注性损伤、动脉粥样硬化、高血压等非感染性损伤介导的心肌纤维化过程中发挥着十分重要的作用。文章从免疫反应及炎性反应角度出发,就国内外有关TLRs尤其是TLR4在心肌纤维化中可能作用机制研究进展做一综述,希望能进一步阐明心肌纤维化潜在的发生机制,同时也期许为心肌纤维化的防治提供新的视角。     

甲基苯丙胺引起BV2小胶质细胞炎性反应：基于Toll样受体⁃Peli1信号通路的研究

目的：探讨Toll样受体（Toll like receptor,TLR）?E3泛素连接酶Pellino 1（Peli1）介导的炎性通路在甲基苯丙胺（methamphetamine,Meth）引起BV2小胶质细胞炎性反应中的作用。方法：利用Western blot观察Meth作用后Toll样家族中多种TLR的表达及其下游接头蛋白髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）、β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TIR?domain?containing adaptor inducing interferon?β,TRIF）水平的改变,同时观察上述接头蛋白下游Peli1蛋白的表达,利用ELISA、实时定量PCR（real time?PCR）及Western blot观察Peli1调节的下游炎性因子及信号通路的改变。结果：Meth作用于BV2细胞后,TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR11在特定时间内表达明显上调,同时下游MyD88及TRIF蛋白表达显著增加,其中TRIF具有浓度依赖效应。Meth作用后亦可引起泛素化蛋白Peli1的表达,而利用RNA干扰的方法将Peli1下调后,炎性因子诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）?α、白细胞介素（interleukin? 6,IL）?6表达下降,核因子（nuclear factor,NF）?κB的激活明显缓解。结论：TLR介导的炎性信号在Meth引起BV2细胞炎性反应过程中发挥重要作用。因此,基于TLRs?Peli1靶信号轴的干预可能为Meth神经毒性的干预提供靶点,具有潜在的应用意义。     

Toll3受体在呼吸道合胞病毒感染中作用的实验研究

目的探讨呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺上皮A549细胞后,Toll样受体3（TLR3）的水平变化及其产生的I型干扰素的抗病毒作用。方法RSV感染体外培养的人肺上皮A549细胞,并给予TLR3特异性抗体处理,分别感染4h、8h、12h、16h和24h后收集各组细胞。未感染病毒的细胞作为对照组。lit—PCR法检测TLR3、IFN-α、IFN—β,RSVF蛋白的mRNA表达水平变化。结果RSV感染A549细胞后,TLR3、IFN—α、IFN-β,RSVF蛋白的mRNA表达量均升高且有时间依赖性。结论RSV感染A549细胞后可上调TLR3表达,其活化细胞介导产生的I型干扰素能起到抗病毒作用。     

NS2激活TLR7抑制RSV感染肺泡上皮细胞中IFN的表达

目的 探讨非结构蛋白NS2在呼吸道合胞病毒(RSV)感染人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)活化TLR7信号转导过程中的可能作用.方法 以RSV感染体外培养的A549细胞,设立正常对照组、RSV感染组、RSV NS2小干扰RNA沉默组(NS2 siRNA+ RSV组)及TLR7激动剂组(R848+RSV组).各组分别于病毒感染后的4、12、24、48 h收集细胞和培养上清液.Western blot法检测各组不同时间点TRIF、TRAF6及p-IκB-α蛋白表达;ELISA法检测各组细胞培养上清液中Ⅰ型干扰素α(IFN-α)、IFN-β含量的变化.结果 正常对照组中TRIF、TRAF6、p-IκB-α蛋白的表达量较低,经RSV感染之后,随感染时间增加,表达量升高;在NS2siRNA+ RSV组三者表达量较正常对照组上调,但相对于RSV感染组,表达下降,表明RSV NS2可以活化TRIF、TRAF6及p-IκB-α蛋白的表达.RSV感染组及NS2 siRNA+ RSV组、IFN-α、IFN-β含量随感染时间增加逐渐升高,4h开始升高,差异有统计学意义(P＜0.01);R848+RSV组IFN-α和IFN-β呈时间依赖性增加,感染4h升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NS2在病毒感染A549细胞过程中激活TLR7,抑制了IFN-α和IFN-β的表达.     

1,25-二羟维生素D3下调Toll样受体7在树突状细胞中的表达

目的观察1,25-二羟维生素D3对树突状细胞(DC)的表型、功能以及对其Toll样受体7(TLR7)表达的影响,探讨TLR7在1,25-二羟维生素D3诱导耐受性DC可能的机制。方法体外扩增小鼠骨髓来源的DC,采用流式细胞术和混合淋巴细胞反应检测1,25-二羟维生素D3对DC表型和功能的影响;利用RT-PCR半定量方法测定1,25-二羟维生素D3对DC的TLR7表达的影响。结果 1,25-二羟维生素D3处理后,DC表达CD86和MHC II的荧光强度均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);对T细胞的刺激能力较对照组明显减弱(P<0.05);与对照组比较,1,25-二羟维生素D3可以明显下调TLR7的表达(P<0.01)。结论 1,25-二羟维生素D3可能通过下调TLR7的表达抑制DC细胞的成熟,从而使得DC具有耐受性特征。     

Toll样受体3相关信号转导途径与病毒感染

哺乳动物的Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一种重要的模式识别受体,TLR3是Toll样受体家族中的一员,与病毒感染密切相关。本文就TLR3相关信号转导途径与病毒感染及凋亡作一综述。     

Toll样受体7活化调节脐带间充质干细胞免疫原性的实验研究

目的 研究脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC）的Toll样受体7（toll like receptor 7, TLR7）通路活化后,是否会增加UCMSC的免疫原性。方法 用TLR7的激动剂CL264刺激UCMSC后,用流式细胞术检测UCMSC表面共刺激抗原〔人白细胞抗原-E（HLA-E）,CD80,CD86〕和干细胞标志物（CD29,CD59,CD90）的表达变化;定量PCR检测CL264刺激UCMSC后多个免疫相关因子的表达变化;细胞分化实验检测TLR7活化后对UCMSC分化能力的影响;分离健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）并与UCMSC共培养,用细胞杀伤实验检测免疫细胞对UCMSC的免疫杀伤效应。结果 CL264活化TLR7通路后,可明显刺激UCMSC表面共刺激分子CD86和HLA-E的表达;定量PCR结果表明CL264诱导多个促炎症相关因子〔白细胞介素（\IL）-1β,IL-6,IL-8,IL-10,干扰素（IFN）-β,\IFN-γ,核因子-κB（\NF-κB）,转化生长因子-β（\TGF-β）〕表达,并抑制多个干细胞标志物〔Kruppel样因子4（\Klf4）,巢蛋白（Nestin）,胚胎干细胞关键蛋白质（\Sox2）,RNA结合蛋白质（\Lin28）〕表达;TLR7通路活化不影响UCMSC的分化潜能;CL264活化TLR7通路后增加免疫细胞对UCMSC的免疫攻击。结论 TLR7激动剂CL264可增加UCMSC的免疫原性。     

乙型肝炎病毒e抗原对Bewo细胞Toll样受体3表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对Bewo细胞Toll样受体3(TLR3)表达的影响。方法首先用TLR3配体polyI∶C处理Bewo细胞,观察细胞TLR3 mRNA表达的动力学变化。然后将2μg和8μg HBeAg重组质粒pcDNA3.1(+)-HBe转染Bewo细胞,48 h后,用TLR3配体polyI∶C处理12 h。最后,用不同浓度的IFN-β处理Bewo细胞12 h。采用实时荧光定量RT-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN-β水平。结果 polyI∶C可显著诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达(P0.05或0.001),且呈时间和剂量依赖性;与对照组相比,转染8μg HBeAg重组质粒组polyI∶C诱导Bewo细胞TLR3表达及IFN-β水平显著下降(P0.001),IFN-β可显著诱导Bewo细胞表达TLR3 mRNA(P0.001),且呈剂量依赖性。结论 HBeAg可能通过下调IFN-β的产生而抑制Bewo细胞TLR3 mRNA的表达,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。     

Toll样受体3活化对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨Toll样受体(TLR)3活化对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响及其机制。方法 将对数生长期的HUVECs随机分为A组、B组、C组、D组、E组和F组,分别以含0.000、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 mg·L^-1聚肌胞苷酸[Poly (I:C)]的培养基培养24 h,备用。采用Western blot法检测6组HUVECs中TLR3及pro-caspase-3、caspase-3 P17蛋白相对表达量,并计算caspase-3 P17与pro-caspase-3蛋白相对表达量比值(caspase-3 P17/pro-caspase-3)。采用反转录-聚合酶链式反应法检测6组HUVECs中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、死亡受体(DR)4和DR5 mRNA相对表达量。结果 B组、C组、D组、E组、F组细胞中TLR3蛋白相对表达量显著高于A组,C组、D组、E组、F组细胞中TLR3蛋白相对表达量显著高于B组,D组细胞中TLR3蛋白相对表达量显著高于C组,E组、F组细胞中TLR3蛋白相对表达量显著低于D组,F...     

Toll样受体7胞内区功能关键位点筛选及其机制研究

目的 筛选出TLR7 TIR区对其信号传递起关键作用的位点,并解释该位点的作用机制。方法 针对TLR7野生型序列,设计构建一系列TLR7缺失突变与点突变质粒。将这些质粒转染入HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测这些质粒对NF-κB信号通路的影响。利用免疫共沉淀与蛋白质印迹实验验证TLR7突变体与其下游接头蛋白MyD88结合能力的变化。结果 通过对TLR7胞内区截短突变分析,发现在其TIR区存在一个由16个氨基酸残基组成的区域对其信号传递至关重要。进一步的研究发现,该区域存在一个RXR信号基序。该基序位于1004位与1006位的两个保守精氨酸残基,为TLR7正常信号传递所必需。通过免疫共沉淀与蛋白质印迹实验,可以发现TLR7位于1004位的精氨酸对其与下游蛋白MyD88的结合至关重要。结论 成功鉴定出TLR7 TIR区1004位的精氨酸对其信号传递起重要作用,该位点是通过影响TLR7与MyD88结合的方式发挥功能。     

Toll样受体4在创伤后全身炎性反应中的作用与研究

创伤是45岁以下人群死亡的首要原因,残死率极高。在创伤引起的继发病理、生理改变中,全身炎性反应综合征能引起远离创伤部位器官(肺、肝、肾)的功能障碍甚至衰竭,与创伤后多器官功能衰竭的发生、发展密切相关,直接影响创伤的预后和转归。目前对创伤后炎性反应及多器官衰竭综合征的发生机制尚不清楚,因而临床仍缺乏有效的干预手段。Toll样受体(TLR)4可介导无菌性炎性反应,且在组织损伤所致的无菌性炎性反应中起关键作用。因此,TLR4有望成为控制创伤后炎性反应的研究热点。