膀胱癌中GDF15基因启动子区甲基化检测及逆转其甲基化状态对5637膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的 检测生长分化因子15(GDF15)在膀胱癌中的甲基化状态,探讨其启动子区异常甲基化对于膀胱癌发生发展的作用.方法 应用重亚硫酸盐测序PCR(BSP)联合T-载体PCR产物(TA)克隆检测人膀胱移行细胞癌细胞系5637、HT1376、KU19-19、膀胱癌组织、癌旁组织、正常组织样品中GDF15启动子区甲基化状态,并用甲基化酶抑制剂5-Aza-2-deoxycitydine(5-Aza-dc)处理5637,观察处理前后平均甲基化率的变化情况,Western blot法检测5637处理前后蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖情况,划痕实验检测迁移情况,Transwell法检测侵袭能力.结果 5637、HT1376、KU19-19细胞中GDF15启动子区平均甲基化率为89.29%、10.71%、8.33%,肿瘤组织、癌旁组织及正常组织分别为86.91%、9.52%、5.95%,膀胱癌组织中 GDF15启动子区甲基化率较癌旁组织和正常组织中高,差异有统计学意义(P<0.05);5-Aza-dc可以逆转5637中GDF15的甲基化状态:与处理前相比,处理组5637细胞系GDF15蛋白表达增加,增殖、迁移、侵袭能力下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论 膀胱癌中GDF15基因表达与甲基化状态有关,启动子区高甲基化导致基因沉默,逆转甲基化状态可以使基因蛋白表达增加,细胞增殖、迁移、侵袭能力均降低.GDF15基因甲基化异常状态有可能成为膀胱癌诊断的潜在靶点.     

TMEFF2与恶性肿瘤关系的研究进展

TMEFF2是表皮生长因子(EGF)蛋白家族的新成员,其包含1个EGF样结构域和2个卵泡抑素样结构域,是一种高度保守的跨膜蛋白.TMEFF2蛋白在多种恶性肿瘤中均表达异常,且在不同类型肿瘤中发挥的作用不同.TMEFF2既可作为促癌因子,又可作为抑癌因子,但其调控肿瘤发生、发展的作用机制目前仍未明确.此外,在胃癌、结直肠...     

PITX2启动子甲基化及其与膀胱癌临床病理的关系

目的:由于近些年表观遗传学的发展,基因启动子甲基化检测在预测癌症诊断预后方面拥有巨大的潜力。PITX2启动子的高CpG岛增加其甲基化程度,其能够成为新的膀胱癌预测因子。方法: QRT-PCR检测永生化膀胱上皮细胞系（SV-HUC）和3种膀胱癌细胞系（EJ、5637、T24）以及癌组织和癌旁组织的差异性表达。通过DNA甲基化测定实验对33例全膀胱切除术切除癌组织进行甲基化程度测定,分为大于50%甲基化,小于50%甲基化建立甲基化程度与肿瘤分期分级的联系。结果:使用实时定量RT-PCR（Q-PCR）证明PITX2在膀胱癌细胞中高表达。癌组织中甲基化程度明显高于癌旁组织。PITX2启动子甲基化与肿瘤大小（P =0.026 7）、高级别（P =0.027 7）和TNM分期（0.016 0）显着相关。在预测肿瘤侵袭（T2-T4肿瘤）中,PITX2启动子甲基化的ROC曲线下面积（AUC）为0.867。 Kaplan-Meier生存分析表明,与低PITX2甲基化表达的肿瘤相比,高PITX2启动子甲基化表达的肿瘤与较短的总体存活相关。结论:PITX2在膀胱癌组织中异常高表达,并且PITX2启动子区域在癌组织中存在高甲基化是患者不良预后的独立危险因素,因此,PITX2启动子甲基化可能成为膀胱癌肿瘤发生进展有效的预测因子。     

microRNA启动子区甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响

目的研究microRNA启动子区甲基化水平的变化对几种microRNAs（miRNA34a、miRNA34b、miRNA148a、miRNA203a）表达的影响,并进一步研究该甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移以及侵袭能力的影响。方法不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR) 处理人肺癌细胞A549,分别作用24 h、48 h、72 h,采用CCK8法检测细胞增殖情况,计算增殖抑制率。20 μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞72 h,通过甲基化特异性PCR(MSP)检测A549细胞相关miRNAs启动子甲基化水平的变化;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测A549细胞相关miRNAs表达水平的变化。20 μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞0 h、24 h、48 h,采用划痕实验检测细胞迁移能力（计算细胞在24 h和48 h的划痕愈合率）;作用48 h,采用Transwell检测细胞侵袭能力。结果CCK8结果显示,随着5-Aza-CdR的处理浓度升高、时间延长,A549细胞的增殖抑制率逐渐增加。经5-Aza-CdR去甲基化处理后,MSP结果表明,实验组相对于对照组甲基化引物扩增条带减弱,而非甲基化引物扩增条带增强;Real-time PCR结果显示,相关miRNAs表达水平升高（P<0.05）。由划痕实验和Transwell检测结果揭示,经5-Aza-CdR处理后,A549细胞的生长愈合能力降低（P<0.05）,并且侵袭到Transwell小室滤膜下表面的细胞数亦减少（P<0.05）。结论人肺癌细胞A549经5-Aza-CdR去甲基化处理后,miRNAs表达水平升高,进一步抑制肺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。     

TMEFF2基因对SH-SY5Y细胞增殖的影响

目的探讨TMEFF2基因过表达对体外培养SH-SY5Y细胞增殖的影响。方法克隆全长的TMEFF2基因,连接入pEGFP-N2载体。以脂质体包裹重组质粒转染SH-SY5Y细胞。在细胞中可表达生成TMEFF2-EGFP融合蛋白。经G418筛选,建立TMEFF2过表达细胞株,同时筛选作为对照的pEGFP-N2稳定转染细胞株。MTT法测定TMEFF2过表达细胞株和pEGFP-N2稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞增殖。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-TMEFF2,并筛选得到稳定表达细胞株。在细胞接种密度较高时,TMEFF2过表达细胞株的增殖较pEGFP-N2稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞株均明显降低。结论TMEFF2基因可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖,且抑制作用具有明显密度依赖性。     

膀胱癌中eya4基因启动子区甲基化状态及其临床意义

目的 探讨膀胱癌细胞系和膀胱移行细胞癌组织中EYA转录共激活磷酸酶4(eya4)基因启动子区CpG岛甲基化状态及在临床病理特征中的意义.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测eya4基因在5株膀胱癌细胞系、1株膀胱永生化上皮细胞系和75例膀胱移行细胞癌组织及癌旁组织,并结合临床病理特征行统计学分析.结果 eya4基因启动子区在5株膀胱癌细胞系中,有4株出现甲基化,其甲基化率为80%;在人正常膀胱细胞系中甲基化阴性.eya4在膀胱癌组织中的甲基化率为70.7%(53/75),显著高于癌旁组织(24%,18/75),差异有统计学意义(x2=32.760,P<0.01).eya4基因启动子区CpG岛甲基化在临床病理特征中如单发膀胱肿瘤与多发膀胱肿瘤相比,直径≤3 cm的膀胱肿瘤与＞3 cm的膀胱肿瘤相比,低级别膀胱肿瘤与高级别膀胱肿瘤相比,浅表性膀胱肿瘤与浸润性膀胱肿瘤相比,差异均有统计学意义(P<0.05),但与年龄和性别无关.结论 基因eya4启动子区甲基化与膀胱癌的发生发展有关,可能作为膀胱移行细胞癌诊断的一个新的标志物.     

膀胱癌DNA甲基化研究进展

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。作为表观遗传学的重要组成部分,DNA甲基化改变了基因的正常表达,在肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用。目前关于膀胱癌中DNA异常甲基化的研究越来越多,一些可能的候选基因作为膀胱癌早期诊断和风险评估肿瘤标志物的筛选取得了一些令人期待的结果,而其在膀胱癌中的敏感性和特异性仍需进一步研究。现就膀胱癌甲基化目前的研究状况及应用前景进行简要综述。     

死亡相关蛋白激酶启动子区甲基化状态与膀胱癌的关系

目的探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)在膀胱癌中CpG岛的甲基化状态及其意义。方法收集40对新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织;采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)检测DAPK基因启动子区CpG岛的甲基化状态;并对MSP产物进行TA克隆。结果40对癌组织及其癌周正常组织中,7例癌组织检测到DAPK异常甲基化,1例癌周正常组织检测到异常甲基化(7/40vs.1/40,P>0.05);原发性与复发性膀胱癌中的甲基化阳性率分别为2/15、5/25,二者差异无显著性(P>0.05);在不同分级、分期膀胱癌中的差异均无显著性(P>0.05)。结论DAPK启动子在膀胱癌中的甲基化阳性率较低,并且与膀胱癌的分级、分期无相关性,因而在选择分子学指标辅助膀胱癌早期诊断时,DAPK的甲基化检测需慎用。     

膀胱癌DNA甲基化的研究进展

在恶性肿瘤中,相关的癌基因或抑癌基因由于异常的甲基化导致了其表达的升高或降低这一生物学改变普遍存在.膀胱癌作为泌尿系统肿瘤中死亡率和复发率很高的恶性肿瘤,其相关基因的甲基化状况也是很多学者研究的热点,本文将就其相关研究进展做一综述.     

DARS2调控EGFR促进膀胱癌的EMT、迁移及侵袭

目的 探讨线粒体天冬氨酰-tRNA合成酶2(DARS2)对膀胱癌细胞上皮间质转化(EMT)、迁移及侵袭的作用及其机制。方法 利用TIMER和GEPIA数据库分析DARS2在膀胱尿路上皮癌(BLCA)中的表达及其与临床病理分期的关系。RT-qPCR检测人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1,膀胱癌细胞5637、T24和TCCSUP中DARS2 mRNA水平。TCCSUP细胞分为：control组(未转染)、si-NC组(转染阴性对照siRNA)、si-DARS2-1组(胞转染DARS2 siRNA-1)、si-DARS2组(转染DARS2 siRNA-2)、si-DARS2+Vector组(转染DARS2 siRNA-2+空载质粒)和si-DARS2+OE-EGFR组(转染DARS2 siRNA-2+EGFR过表达质粒)。Western blot检测DARS2,EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及EGFR的表达水平。Transwell侵袭和细胞划痕实验分别检测细胞侵袭能力和迁移能力。结果 DARS2 mRNA水平在BLCA中显著上调,并与病理分期正相关...     

肌动蛋白γ2对膀胱癌细胞迁移的抑制作用以及甲基化对其表达的调控作用

目的:探讨肌动蛋白γ2(ACTG2)在膀胱癌中的表达情况,研究ACTG2对膀胱癌细胞增殖和迁移的影响,初步探讨甲基化对其的表达调控。方法:RT-PCR检测ACTG2在膀胱癌组织以及细胞系中的表达情况,构建ACTG2过表达质粒。通过MTT实验、平板克隆实验和Transwell迁移实验分别检测过表达ACTG2对膀胱癌细胞增殖、克隆形成能力以及迁移的影响。MethHc数据库预测ACTG2在膀胱癌组织中的甲基化情况,使用去甲基化药物地西他滨处理膀胱癌细胞研究甲基化对ACTG2的调控作用。结果:ACTG2在膀胱癌组织以及膀胱癌细胞系中表达水平都显著下调,过表达ACTG2可以抑制膀胱癌细胞的迁移,对膀胱癌增殖能力没有明显影响。DNA甲基化是ACTG2在膀胱癌中表达水平下降的重要原因。结论:ACTG2在膀胱癌中有抑癌功能,其表达水平受DNA甲基化调控。     

TMEFF2基因对人胚肾细胞生物学行为的影响

目的 探究TMEFF2基因对人胚肾细胞生物学行为的影响及可能的机制。方法 构建基因低表达载体shRNA-TMEFF2,将实验组shRNA-TMEFF2、对照组NC-TMEFF2的DNA分别转染进入HEK293细胞;采用qPCR和Western印迹法检测TMEFF2的表达;用CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡率;用RNA-seq分析TMEFF2基因低表达对HEK293细胞基因表达谱的影响;划痕法和Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力的变化。结果 实验组中mRNA及蛋白水平明显降低;细胞增殖能力显著降低;细胞周期阻滞在G1期且凋亡率增高;细胞迁移、侵袭的能力均受到抑制,差异均具有统计学意义(P均<0.05);RNA-seq显示实验组共有4769个基因表达差异有统计学意义,其中2355个基因上调,占49.4%,2414个基因下调,占50.6%。结论 TMEFF2基因低表达能抑制HEK293细胞的增殖,抑制HEK293细胞迁移、侵袭的能力,可能促进细胞的凋亡,其作用机制可能与RGCC及ADGRL1-FLRT信号通路有关。     

KIF26B在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的 基于公共数据库分析驱动蛋白家族成员26B(kinesin family member 26B, KIF26B)在膀胱癌中的表达水平,并探讨沉默KIF26B对膀胱癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。方法 基于GEO和UaLcan数据库分析KIF26B在膀胱癌中的表达及与患者生存预后的关系;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot法检测膀胱癌细胞系(T24、J82)及膀胱正常上皮细胞SV-HUV-1中KIF26B的表达水平;将si-KIF26B、si-NC片段转染至T24细胞,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法、Transwell实验和划痕实验检测沉默KIF26B后对T24细胞增殖、侵袭和迁移的影响;Western blot法检测沉默KIF26B后丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶(phosphorylated mitogen-activated protein kinase kinase p-MEK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulatory protein kinase,p-ERK)蛋白的表达水平。结果 KIF26B在膀胱癌组织中高表达,KIF26B高表达患者的预后更差(P＜0.05)。KIF26B在膀胱癌细胞系T24、J82中的表达水平显著高于膀胱正常上皮细胞SV-HUV-1(P＜0.05)。沉默KIF26B基因后,MTT、Transwell和划痕实验结果显示,T24细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显下降(P<0.05);沉默KIF26B后,T24细胞中p-MEK、p-ERK蛋白的表达下调(P<0.05),而MEK、ERK蛋白无明显变化(P＞0.05)。结论 KIF26B在膀胱癌组织和细胞中高表达,与患者预后不良相关,沉默KIF26B可抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能通过MEK/ERK通路发挥作用。     

抑制 DBC2 基因启动子甲基化促进乳腺癌细胞凋亡的研究

研究抑癌基因 DBC2 在乳腺癌的表达与甲基化状态之间的联系,及其对乳腺癌细胞系T-47D 细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养 3 种乳腺癌细胞株（T-47D、MCF-7、MDA-MB-23）和正常乳腺细胞株（MCF-10）,检测 4 种细胞中 DBC2 基因的表达及其启动子区甲基化状况;5-Aza-CdR 处理T-47D 细胞后,检测 5-Aza-CdR 对 T-47D 细胞 DBC2 启动子甲基化状态和其表达的影响,并通过 MTT 和Annexin-V/PI 双染法分别检测处理前后 T-47D 细胞增殖和凋亡的变化。结果DBC 2 在 T-47D 细胞表达缺失,乳腺癌细胞DBC 2 启动子发生甲基化;5-Aza-CdR 成功逆转了 T-47D 细胞DBC 2 的甲基化状态,并使DBC2 mRNA 表达恢复（ <0.05）;不同浓度的 5-Aza-CdR 处理 T-47D 细胞后,T-47D 细胞增殖下降（ <0.05）,凋亡率增加（ <0.05）。结论 DBC2 启动子甲基化导致 T-47D 细胞 DBC2 表达沉默,激活DBC2 表达可抑制 T-47D 细胞增殖并促进其凋亡。     

circRNA CCND1对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

目的 探讨circRNA CCND1对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法 采用荧光原位杂交(FISH)实验及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测circRNA CCND1在HepG2细胞及L02细胞中的表达情况;进一步干扰及过表达circRNA CCND1后,通过qRT-PCR检测circRNA CCND1在HepG2细胞中的表达情况,CCK-8法和EDU法检测HepG2细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期,Transwell实验检测细胞侵袭情况,划痕实验检测细胞迁移情况。结果 HepG2细胞circRNA CCND1相对表达量较LO2细胞高(P <0.05)。Si-circRNA CCND1组circRNA CCND1相对表达量较Control组和Si-NC组下降(P <0.05),Oe-circRNA CCND1组较Control组和Oe-NC组升高(P <0.05)。各组细胞培养0、24、48、72和96 h后细胞增殖活性比较,经重复测量设计的方差分析,结果：(1)不同时间点细胞增殖活性比较,差异有统计学意义(P <...     

荧光定量PCR检测膀胱癌患者尿沉淀细胞TWIST1基因启动子甲基化状态的临床价值

目的:评估尿沉淀细胞TWIST1基因启动子甲基化状态在膀胱癌诊断中的价值?方法:用实时荧光定量PCR的方法,对50例临床确诊的膀胱癌患者?13例非肿瘤性尿路疾病患者?7例健康志愿者检测了尿沉淀细胞TWIST1基因启动子的甲基化状态;同时行尿脱落细胞学检查?结果:50例膀胱癌患者中尿脱落细胞TWIST1基因启动子甲基化阳性率为64.0%(32/50),对照组均未发现甲基化改变,两者比较差异有统计学意义(P < 0.01)?TWIST1基因启动子甲基化率有随组织分期升高的趋势,但在不同分级?分期膀胱癌中的差异无显著性?实时荧光定量PCR法检测尿液中TWIST1基因启动子甲基化的敏感性和特异性分别为64.0%?100.0%?而尿脱落细胞学检查阳性率为48.0%(24/50),其敏感性和特异性分别为48.0%和100.0%?结论:尿脱落细胞TWIST1基因启动子的甲基化检测诊断膀胱癌敏感性和特异性均较高,且无创?无痛苦,可作为早期诊断膀胱癌的敏感指标?     

miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响

目的：研究 miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭、迁移能力的影响及其可能机制。方法将 miR-98mimics、mimics-NC、miR-98inhibitor、inhibitor-NC 瞬时转入肝癌 HepG2细胞内,应用噻唑盐( MTT)法、流式细胞仪、Tr-answell 小室实验检测 miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响,进一步用 Western blot 法检测各组 Bcl-2蛋白的表达水平。结果 MTT 实验表明 miR-98过表达后,肝癌细胞的增殖能力明显低于对照组;Annexin V-FITC / PI 凋亡实验证实上调 miR-98表达后,细胞的凋亡率较对照组升高;Transwell 小室实验表明上调 miR-98可使肝癌细胞的侵袭、迁移能力减弱。而当 miR-98被抑制后,肝癌HepG2细胞的增殖及侵袭、迁移能力则明显增强,凋亡率则下降。 Western blot 实验检测发现 miR-98过表达后,Bcl-2的表达降低。结论 miR-98可能在肝癌的发生、发展中发挥着抑癌基因的作用;miR-98可能通过下调 Bcl-2的表达,促进肝癌 HepG2细胞凋亡。     

CDK8、STAT1和TMEFF2在大肠组织中的表达及意义

目的探讨CDK8、STAT1、TMEFF2在大肠癌、大肠腺瘤及正常大肠黏膜组织中的表达情况及与临床病理特征之间的关系,探讨其在大肠癌发生、发展中的可能作用。方法组织标本均取自结肠镜活检组织标本,采用免疫组化Evision两步法,分别检测CDK8、STAT1和TMEFF2在不同大肠组织中的表达情况,并分析其与临床病理特征之间的关系。结果 CDK8表达定位于细胞核,其在100例大肠癌、15例大肠腺瘤、15例正常大肠黏膜组织中的表达率分别为37%(37/100)、0(0/15)和0(0/15),CDK8在大肠癌中的表达率明显高于大肠腺瘤和正常大肠黏膜组织(P<0.05),且其表达与患者其他各临床病理因素无明显关系(P>0.05)。STAT1表达定位于细胞浆和细胞核,其在100例大肠癌、15例大肠腺瘤、15例正常大肠黏膜组织中的表达率分别为26%(26/100)、73%(11/15)和67%(10/15),STAT1在大肠癌中的表达率较大肠腺瘤和正常大肠黏膜明显降低(P<0.05);STAT1在结肠癌中的表达率明显高于直肠癌(P<0.05),且其表达与患者其他各临床病理因素无明显关系(P>0.05)。TMEFF2在15例正常大肠黏膜、15例大肠腺瘤和15例大肠癌中均无表达。结论 CDK8在大肠癌中表达异常升高,提示CDK8在大肠癌的发生、发展中起重要作用;STAT1在大肠癌中表达下调,与大肠癌的形成及发展密切相关,STAT1的表达与肿瘤位置相关。TMEFF2在大肠癌中表达缺失,可能不参与大肠肿瘤的发生、发展过程。     

转移相关基因2对喉癌细胞系Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨转移相关基因2(MTA2)对喉癌细胞系Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响。方法:通过针对MTA2基因的小干扰RNA(siRNA-MTA2)对MTA2基因表达进行下调,采用RT-PCR和Transwell检测转染,作为实验组,对照组转染阴性对照(sicontrol),通过MTT、细胞划痕实验和Transwell法分别检测MTA2对Hep-2的增殖、迁移和侵袭的影响。结果:实验组MTA2mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05),实验组培养7d和9d时细胞增殖能力明显低于对照组(P<0.05),实验组细胞迁移能力和细胞侵袭能力明显低于对照组(P<0.05)。结论:MTA2与喉癌细胞系Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭密切相关,有望成为治疗喉癌的靶点。