用原位缺口翻译法研究棉酚、雷公藤总甙对DNA的损伤作用

本文报道用原位缺口翻译法,研究男用节育药醋酸棉酚和雷公藤总甙(GTW)对C3H-10 T 1/2小鼠成纤维细胞DNA的作用。结果表明,在较高浓度的醋酸棉酚或GTW(2～3μg/ml)作用4小时,细胞核中显示的银颗粒较多,如阳性对照组的N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG)组;在中等浓度的(0.5～1μg/ml)作用下,银颗粒显著地少得多;在较低浓度的醋酸棉酚或GTW作用下(0.1～0.3μg/ml),细胞核中呈现的银颗粒与阴性对照组相似。与原位缺口翻译实验相对应,集落形成试验表明,在高浓度醋酸棉酚或GTW作用下,细胞失去繁殖的能力;而在中等或较低浓度的药物作用下,仍有较高的集落形成率。这些观察表明,高浓度的醋酸棉酚或GTW对细胞DNA有严重的损伤作用,而在中等浓度的药物作用下,DNA受到某种程度的损伤,但可修复;低浓度的醋酸棉酚或GTW对细胞DNA无明显的损伤作用,本文对这些结果的意义进行了简要的讨论。     

棉酚的药理作用研究

棉酚(gossypol)是一种天然黄色多酚类化合物,主要存在于棉花的根、茎和种子中。最早作为一种男性节育药为人们所熟知,后又试用于治疗女性激素依赖性疾病,包括子宫内膜异位症、子宫肌瘤、功能失调性子宫出血和痛经等。进一步研究发现,棉酚具有多种生物活性,如抗炎、抗疟、抗病毒及抗氧化等,尤其是具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。     

棉酚对大鼠毒性的电子显微镜观察

棉酚对雄性大鼠有明显的抗生育作用。用电镜和同位素放射自显术对服药后大鼠睾丸变化动态的观察表明棉酚主要破坏生精上皮的精子发生过程,其中变态期精子细胞和中、后期初级精母细胞对棉酚的毒性最为敏感。4000多名志愿服药者的临床试验进一步证明了棉酚的抗生育效果肯定可靠。精液脱落细胞的分析亦以精子细胞和精母细胞的脱落为主。棉酚对生精细胞的这种毒性作用,为当前寻找男用避孕药提供了前景。棉酚对其他脏器组织的毒性作用亦已有报道。猪服棉酚后可引起心肌损伤,肝、脾、肾     

阿霉素及棉酚双药纳米载体对U87胶质瘤细胞的协同抑制作用

目的:建立一种具有协同治疗效果的阿霉素及棉酚双药纳米载体,并检测其协同抗神经胶质瘤的效果。方法:通过MTT法检测阿霉素和棉酚对人脑胶质瘤细胞U87的协同抑制作用,使用透明质酸和阳离子两亲性淀粉为材料构建双药纳米载体,并对其性能进行表征,利用荧光标记的纳米载体观察其在U87细胞和体内模型上的靶向递送水平,最后检测双药纳米载体体内抗肿瘤效果。结果:阿霉素和棉酚针对U87细胞有显著的协同抑制效果,所制备的双药纳米载体粒径为145.7 nm±5.6 nm,棉酚的包裹率为93.8%±2.5%载药量18.2%±2.1%;盐酸阿霉素的包裹率为89.4%±4.7%载药量1.9%±0.6%,72 h阿霉素释放率小于40%,低于40℃环境下稳定时间超过5周。药纳米载体可在1 h内即可在U87细胞中达到较高的积累量,并持续释放携带的药物,细胞抑制效果与游离双药一致,体内实验表明,双药纳米载体可有效靶向肿瘤组织,体内抑瘤效果显著,抑瘤率高于90%,明显好于游离给药组,且毒性降低。结论:阿霉素与棉酚双药纳米载体可将两种药物有效递送至肿瘤组织和细胞内,并发挥出显著的协同抑瘤作用。     

棉酚对多克隆激活剂活化人T淋巴细胞的抑制作用

目的:以体外培养的人外周血单个核细胞为材料,研究多酚类抗生育药物棉酚对正常人外周血T淋巴细胞体外活化作用的影响。方法:利用双荧光染色流式细胞术分析棉酚对人T淋巴细胞在丝裂原或佛波醇酯刺激下早期活化抗原CD69表达的影响。结果:100μmol/L的棉酚预先与T细胞温育,能完全抑制10mg/L植物血凝素(PHA)刺激的CD3^＋T细胞活化抗原CD69的表达,又可阻断10^－7mol/L佛波醇酯(PDB)对T细胞的活化作用。这种抑制作用呈剂量依赖性,棉酚对PDB及PHA抑制作用的IC₅₀分别为(35.7±2.9)μmol/L和(32.8±1.5)μmol/L。此外,棉酚对CD3^－的淋巴细胞CD69表达也有类似的抑制作用。然而,它对多克隆激活剂引起的T细胞表面分子CD3的下调无明显影响。结论:在体外活化模型中,棉酚能够同时抑制多克隆激活剂PHA和PDB对T细胞的活化作用,提示其作用部位可能位于PKC或下游,并提示棉酚具有潜在的免疫调节作用。     

γ射线辐照外周血单个核细胞联合左旋棉酚体外杀伤LNCaP细胞的作用

目的:观察低剂量辐射外周血单个核细胞(PBMC)联合左旋棉酚对体外培养人前列腺癌LNCaP细胞的杀伤作用。方法:采用l Gyγ射线照射人PBMC,辐射剂量率为17Gy/min,实验设对照组、照射及未照射的PBMC与LNCaP细胞共培养组、左旋棉酚处理组及照射的PBMC与左旋棉酚联合作用组。利用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光双染色法及MTT法,观察PBMC和/或左旋棉酚对肿瘤细胞的杀伤情况。结果:辐照的PBMC及左旋棉酚处理组对LNCaP细胞的杀伤作用明显增强,杀伤活性明显高于未辐照组(P0.05),而联合作用组的杀伤活性明显高于辐照组及左旋棉酚处理组(P0.01)。结论:低剂量辐射PBMC联合左旋棉酚可以明显提高其体外的抗肿瘤效应。     

醋酸棉酚对HeLa细胞作用的透射电镜和扫描电镜观察

本文报道人体子宫颈癌HeLa细胞系细胞的超微结构,及其在培养液中加入10,20μg/ml醋酸棉酚,作用24,48h后的变化状态。HeLa细胞在常态生长情况下,具有一般癌细胞的超微结构特点。在醋酸棉酚的作用下,这些细胞间的紧密连接未见发生改变。而在细胞内,线粒体首先发生变化,由肿胀、嵴断裂、空泡化,直至溶解成颗粒状物。棉酚对HeLa细胞的损害作用,具有剂量相关性和作用时间相关性。在棉酚浓度加大和作用时间增长时,可见除线粒体以外的其他细胞器的改变,包括溶酶体大量增多、核膜受损及核内异染色质改变等。扫描电镜下,可见微绒毛断落,细胞表面出现极不正常的泡状突起。本文还对棉酚损伤HeLa细胞的性质及其意义进行了讨论。     

棉酚所致低钾血症机制的研究

棉酚是我国首创的男性避孕药,效果肯定。但部分棉酚受试者出现低钾血症,这成为临床上应用棉酚的主要障碍。本文研究了醋酸棉酚对人类红细胞Na~+、K~+跨膜流动的作用,观察了其对新鲜红细胞内Na~+、K~+浓度的影响,并测定了棉酚受试者红细胞内Na~+、K~+浓度及红细胞(Na~+,K~+)联合转运的活性,就棉酚引起低钾血症的机制提出了一种新的见解。     

醋酸棉酚对人体精子的影响——精子的细胞学、细胞化学及电镜的观察

在城市及农村两组连续口服醋酸棉酚分别为15毫克/天和22.5毫克/天的不同时间后,分别取精液作细胞学、细胞化学及超微结构的观察。与服药前自身对照相比较,分析了棉酚的抗精子发生的作用效应。精子计数与细胞学分析结果表明:口服棉酚四周后畸形率增高者不多,而八周后在精子数目剧减的同时,涂片内脱落生精细胞(主要为精母细胞及精子细胞)明显增多,反映了棉酚作用部位主要为精子发生过程中的变态期精子细胞和中、晚期精母细胞。服用棉酚后可引起精子中段SDH活性减弱及线粒体超微结构的损伤(空泡化,排列紊乱到线粒体的全部消化)表明棉酚对精子能源代谢有一定的抑制作用,但对精子顶体PLE的影响则似为继发性性质。口服棉酚后可见精子核内染色质的超微结构产生异常变化,提示了棉酚影响精细胞核酸代谢的可能性。     

棉酚对大鼠垂体、肾上腺和下丘脑作用的组织化学观察

棉酚对男性是具有一定抗生育作用的,经多方面有关资料的介绍,及根据我们实验材料的观察也得到证实。棉酚的作用环节主要是损伤早期精子细胞和粗线期精母细胞;而对间质细胞可能有轻度影响。睾丸是受垂体促性腺激素的调节,包括促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)。这两种激素又受下丘脑分泌的促卵泡素释放激素(FRH)及促黄体素释放激素(LRH)的影响。我们根据棉酚对睾丸作用的情况,认为对垂体和下丘脑有进一步研究和探索的必要。另外,肾上腺是一种高度敏感和应激的器官,对性腺也有密切的关系。因此我们也观察了肾上腺皮质的组织化学变化,作为研究棉酚作用的辅助。     

缺钾加强棉酚的抗生精作用

棉酚于1972年首次试用于临床时即表明确有男子节育作用,但木品尚存在一些副作用,如不加以克服,上述希望将甚难实现。重要副作用之一为少数对象长期服用棉酚后,精液数目不能恢复以至发生绝育症。对此,一般仅认为是个体差异的结果,并无满意的解释。本工作为试图阐明此问题而进行。     

蛋白激酶C抑制剂对T细胞表达IL-2及IFN-γ的影响

目的:研究蛋白激酶C(PKC)抑制剂H7和棉酚对体外活化T细胞表达白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(INF-γ)的影响。方法:在莫能菌素(monensin)存在时,以佛波醇酯(PDB)+离子霉素(I)体外活化人外周血单个核细胞(PBMC),以流式细胞术胞内细胞因子检测法分析H7和棉酚对CD3⁺T细胞表达IL-2和IFN-γ水平的影响。结果:PDB+I处理PBMC4h后,表达IL-2和IFN-γ的CD3⁺T细胞百分率分别为16.64±2.04和25.81±3.53(x±s),而对照组二者的比率为1.06±0.22及3.12±0.77(P＜0.05)。棉酚(50μmol/L)可明显抑制IL-2及IFN-γ的表达,抑制后表达率分别为2.08±0.12及9.01±1.90。H7作用比棉酚强,50μmol/L的H7抑制后的IL-2及IFN-γ阳性T细胞比率分别为0.43±0.06和2.40±0.27。结论:PKC在CD3⁺T细胞表达IL-2及IFN-γ中发挥重要作用;PKC抑制剂H7及棉酚明显抑制IL-2及IFN-γ的表达,提示H7和棉酚可通过抑制PKC活性,对依赖于T细胞功能的特异性免疫应答有调节作用。     

停服棉酚后恢复的大鼠精母细胞DNA合成的研究

用细胞淘析分离技术分离出经棉酚处理后的大鼠粗线期精母细胞，用＾３Ｈ－胸腺嘧啶核苷参入法检测棉酚对ＤＮＡ合成的影响。结果表明，饲服棉酚３、４、６、７和８周后，大鼠粗线期精母细胞的ＤＮＡ合成明显低于对照组，分别降低１４％、２６％、４０％、４２％和４０％。本文对棉酚的作用机理进行了讨论。     

动物Na-K-ATP酶活性变化与棉酚相关的研究

本文报道用光镜组织化学、电镜细胞化学定位和生化测定的方法分析棉酚对动物肾小管及腓肠肌Na-K-ATP酶活性的影响。实验结果表明: 1.细胞化学反应显示了Na-K-ATP酶定位于腓肠肌肌膜,肾远曲小管的基底膜和细胞反褶膜以及髓袢升支的细胞膜上。肾集合管与近曲小管的基底膜及细胞反褶膜上亦有轻微的阳性反应。 2.抗生育剂量棉酚(10毫克/公斤,20毫克/公斤,30毫克/公斤)对大鼠和豚鼠的Na-K-ATP酶组化反应未见有明显的影响,雄猴实验亦得到类似结果。但当棉酚剂量加大到60毫克/公斤时,大鼠和豚鼠的肾小管及腓肠肌的Na-K-ATP酶反应均明显减弱。豚鼠肾细胞膜酶活性的生化定量测定结果亦表明棉酚对肾的Na-K-ATP酶活性有明显的抑制作用。这一结果表明棉酚可引起Na-K-ATP酶活性的降减,而且与剂量成正相关,为棉酚引起肾性失钾的可能性提供了实验依据。本文对细胞膜Na-K-ATP酶细胞化学定位、酶活性以及棉酚对该酶抑制作用的可能机理进行了讨论。     

停服棉酚后恢复的大鼠精母细胞生物活性的研究

棉酚是一种有效的男用避孕药及抗肿瘤药物,但对长期喂服棉酚后,被抑制的精原细胞的生物活性研究尚少。本实验用成年雄性大鼠,喂服棉酚3、4、6、7、8周,停药15天后,被抑制的精原细胞恢复功能,重新进入减数分裂期和粗线期。用流式离心技术,将大鼠睾丸细胞分离成6个组分,组分6,90％以上为第一期恢复的粗线期精母细胞(RPS)。将RPS和对照组细胞(CPS)在体外进行培养,利用~3H-胸腺嘧啶核苷的掺入测定其DNA合成。结果表明,不同时间喂服棉酚,恢复后的粗线期精母细胞与对照组相比,DNA合成明显低于对照组。喂服棉酚3、4、6、7、8周后,RPS组DNA     

棉酚对人体外周血淋巴细胞染色体畸变和姐妹染色单体交换频率影响的研究

棉酚为男性抗生育的有效药物,国内外学者已从生殖生理、药物毒性毒理和遗传效应等方面进行了广泛的研究。已有报道,口服棉酚后,大鼠精原细胞中期染色体和人体外周血淋巴细胞染色体的畸变率,均未发现有统计学意义的改变。小鼠服棉酚后骨髓细胞姐妹染色单体交换频率(简称SCE)亦无变化。但用体外培养的人类细胞敏感实验,对棉酚进行检测则尚未见报道。为此,我们对棉酚是否影响体外培养的人类外周血淋巴细胞的染色体畸变和SCE频率进行了分析。     

棉酚对大鼠生精上皮支持细胞影响的电镜观察

本实验用电子显微镜观察了大鼠口饲棉酚后睾丸生精上皮中支持细胞的超微结构的改变。棉酚每日剂量30毫克/公斤体重,连服4～6周后分别杀死取材,制成超薄切片观察。结果表明服棉酚后支持细胞呈现一系列细胞功能活跃与吞噬功能有关的胞器超微结构改变:溶酶体及脂滴增多,线粒体增生和多形性变化,服药6周后,内质网扩张明显,脂滴堆积,细胞开始处于不活跃状态。结合上述结果,本文对服棉酚后支持细胞超微结构变化的性质及其意义进行了讨论。     

醋酸棉酚对大鼠体内及离体生精细胞蛋白质及核酸合成影响的观察

为了分析棉酚抗生育的作用机理,本实验对大鼠睾丸生精细胞进行了体内和离体的氨基酸并合实验研究。大鼠按每日30毫克/公斤体重的棉酚剂量,连续灌服3,4,6,6周后取材。取材前2小时分别作睾内注射~3H-精氨酸,~3H-赖氨酸和~3H-5-尿嘧啶核苷,按常规取出睾丸制成放射自显片进行观察。离体实验则将上述睾丸中分离的生精细胞与同位素标记的氨基酸分别温育后,测定其并合的放射活性。实验结果表明棉酚对生精细胞并合~3H-赖氨酸和~3H-5-尿嘧啶核苷的能力没有明显影响。但对变态后期(11～19期)精子细胞并合~3H-精氨酸的活动则有明显的干扰作用,标记率明显下降。本实验结果表明进行选择性并合精氨酸替代赖氨酸合成组蛋白阶段的变态后期精子细胞对棉酚较为敏感。对该转换阶段受到干扰与精子丧失受精能力导致不育的可能性进行了讨论。     

低剂量棉酚与甾体激素联合用药对大鼠生精细胞凋亡的影响

采用检测细胞凋亡的微核 (MN)、原位末端标记检测 (ISEL)及单细胞凝胶电泳 (SCGE)等方法 ,研究低剂量棉酚与激素组合用药对大鼠生精细胞凋亡的影响 ,分析不同剂量棉酚 (高剂量 10 0mg/(kg·d)、中剂量 6 0mg/(kg·d)及低剂量 12mg/(kg·d) )及维持量棉酚对生精细胞凋亡及DNA的作用。结果表明不同剂量的棉酚G与单剂量激素H(甲基睾丸素 2 0mg/(kg·d)、炔雌醇 10 0 (g/(kg·d) )合并用药 6周后 ,生精细胞的凋亡系数和微核率随棉酚剂量的增大而增加。高和中剂量棉酚组的凋亡系数分别为 3 5 2 0± 0 4 6 5和 2 0 2 0± 0 0 17,显著高于对照组 (0 2 33± 0 0 88)(P <0 0 5 )。微核率在高剂量组为 2 7 6 33± 3 75 5 ,显著高于对照组 (5 6 0 0± 1 137) (P <0 0 5 ) ;而低剂量组 (3 5 6 7±0 86 9)反而显著低于对照组。服低剂量棉酚G +H 6周后继续服单独低剂量棉酚 (12mg/(kg·d) ) 12周 ,单细胞凝胶电泳未见生精细胞出现DNA单链断裂的彗星状细胞核 ,与高、中剂量组较多的出现率形成明显对照。结果提示低剂量棉酚与甾体激素组合用药在睾丸生精过程中互为调节 ,棉酚引起的生精细胞凋亡效应可在甾体激素的调节下降低而起保护作用     

棉酚对大鼠下丘脑视上核、室旁核和弓状核影响的组织学和组织化学观察

本文应用组织学和组织化学方法,观察了喂饲棉酚(30mg/kg/d×5周及30 mg/kg/d×5周+60mg/kg/周×5周)的成年雄性大鼠下丘脑视上核、室旁核和弓状核神经元的一般形态结构,以及反映神经分泌功能的形态学指标。结果表明,饲药5及10周,上述三个核团神经分泌细胞的光镜形态学,未见明显变化;根据细胞核体积测量、尼氏体和神经分泌物质含量,硫胺素焦磷酸酶和酸性磷酸酶活性的半定量测定,三核团神经分泌活性无显著改变,仅用药5周时,室旁核尼氏体含量增加。这说明抗生育有效剂量棉酚,对大鼠下丘脑没有明显的直接作用;室旁核分泌活性一度增强,可能是大细胞性神经分泌系统,对棉酚引起机体内环境某些改变的生理性调节反应。