肉类掺假的分子生物学检测

针对Gene Bank中公布的牛羊猪鸡鸭线粒体细胞色素氧化酶亚基基因的特异性序列设计引物,建立了肉样的5种常见牛羊猪鸡鸭动物源性成分检测的PCR电泳法体系。采用大连宝生物的猪源牛源羊源鸡源性成分检测试剂盒和广州迪奥生物的鸭源性成分检测试剂盒,利用实时荧光PCR检测体系对河南省范围内几个大型超市的118批次牛肉样品的5种即猪牛羊鸡鸭动物源性成分进行了检测。结果显示:牛源性成分检出117批次检出率99.15%,猪源性成分检出10批次检出率8.47%,鸡源性成分检出7批次检出率5.93%,鸭源性成分检出1批次检出率0.85%,没有检出羊源性成分,其中熟肉制品掺杂其他源性成分的比例较高。与配料表对比掺假使假样品共9批次,总掺假率为7.63%。     

应用实时荧光PCR技术量化检测羊肉中猪源性和鸡源性成份

目的建立羊肉中猪源性成份和鸡源性成份的定量检测方法。方法以新鲜羊、猪和鸡瘦肉为样本提取DNA分子作为检测模板,针对基因组中单拷贝基因设计特异性的引物和探针,应用荧光实时定量PCR技术对模板DNA进行扩增。通过绘制扩增标准曲线和确定羊、猪和鸡的质量与DNA比值常数,对4种不同掺混比例的混合肉样进行定量分析。结果检测质量百分比的绝对误差可以控制在7%以内,量化结果基本准确。结论对于组织成份单一的样品,可以通过在基因组单拷贝基因上设计特异性的引物,利用PCR技术实现在质量水平上对食品中动物源性成份的量化分析,该技术方法的建立可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术支撑。     

常见肉类中鸭源性成分荧光PCR检测方法的建立

目的通过筛选引物、探针体系,优化PCR反应条件,建立常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法。方法针对线粒体基因设计50对引物探针,以鸭DNA为模板,利用PCR和荧光PCR方法筛选引物探针并确定反应条件,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,最终确定荧光定量PCR方法的引物、探针及反应条件。结果当样本含量为0.1%时,本方法仍可特异、灵敏地检出鸭肉成分,检测Ct值可稳定在20以下。结论建立了常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法,可用于肉类制品中鸭源性成分的鉴定。     

利用多重PCR方法检测牛肉中的掺假肉

应用多重PCR方法鉴别牛肉中掺杂其他肉类。通过查阅相关文献,确定牛肉、猪肉、鸡肉、鼠肉的特异性片段设计引物。牛肉样品通过基因提取试剂盒提取组织DNA,然后加入相应特异性牛肉、猪肉、鸡肉、鼠肉引物和反应试剂,采用多重PCR法同时检测牛肉中掺杂鸡肉、猪肉、鼠肉任意三种肉类混合样品。试验建立的复式PCR方法特异性强,操作简便,对于牛肉中掺杂鸡肉、猪肉、鼠肉的检出限均达到1%(W/W)掺杂量。     

实时荧光PCR技术定量检测肉类掺假的研究进展

肉类食品是人们饮食结构的重要组成部分,而近年来,肉类掺假现象频发,严重威胁到公众的利益。因此,建立快速准确的肉类鉴别检测方法逐渐成为一个热点问题。以PCR为基础的实时荧光PCR检测技术在实现定性定量分析的同时,与常规方法相比,具有自动化程度及动态范围更高的特点,在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值。该文从实时荧光PCR检测技术的检测原理出发,进一步探讨其操作流程,并对不同类别的实时荧光PCR检测技术在肉类掺假中的应用进行整合。在肉类鉴定中,实时荧光PCR技术可分为荧光探针法和荧光染料法2大类,近年来在不断发展完善的过程中仍存在着一些挑战,且将向提高检测效率和提高检测结果准确性的方向发展。因此该文提出在已有研究的基础上结合新技术建立标准化检验流程的想法,以期为肉类掺假检测技术的发展起到借鉴意义和指导作用。     

基于便携式荧光定量PCR仪定量检测驴肉中掺假鸭肉

为建立快速方便的驴肉制品分子鉴定方法,本文以驴肉和常见的掺假肉类(鸭肉)为研究对象,筛选特异性引物和TaqMan探针,利用便携式Mini8 Plus实时荧光定量PCR仪进行灵敏度和特异性实验,通过绘制扩增标准曲线及确定驴肉和鸭肉的质量与DNA比值常数,对不同掺入比例(加入定量的鸭肉制成含量分别为20%、40%、60%、80%)的模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法对驴、鸭肉均具有良好的特异性,可以与马、猪、山羊、梅花鹿、牛、鸡、狗肉明显区分;对驴源性DNA成分的检出限为0.01 ng/μL,鸭源性DNA成分的检出限为0.1 ng/μL,对驴肉与鸭肉混合物中鸭肉成分的灵敏度为0.1%(w/w);所建立的标准曲线线性关系良好,驴肉DNA扩增标准曲线:y=-3.584x+27.003,R²=0.9982;鸭肉DNA扩增标准曲线:y=-3.538x+30.907,R²=0.9991;采用已建立的方法对35份驴肉样本进行市场试点调查,发现6份(17.1%)驴肉样本中含有鸭肉成分。以上研究结果说明,该实时荧光定量PCR方法可用于驴肉产品中其他...     

荧光假单胞菌快速检测方法优化及在鸭肉中的检测效果评价

通过建立与优化荧光定量PCR检测的条件,对荧光定量PCR的特异性、最低检出限进行评估,并对其在冷藏鸭肉样品中的检测效果进行评估。结果表明,优化后的退火温度为60℃,探针浓度为500 nmol·L^-1;60株受试菌株的特异性验证试验结果表明,所构建的方法具有极高的特异性;扩增效率和最低检出限评估结果表明,该方法的扩增效率良好,检出限为10² CFU·g^-1;利用构建的快速检测方法对冷藏期间生鲜鸭肉产品中的荧光假单胞菌进行检测,未减菌组产品中有荧光假单胞菌检出,其数量随贮藏时间的延长而逐渐增加。本文优化后的基于荧光定量PCR技术的荧光假单胞菌快速检测方法特异性好、检测效率高,可在5 h内实现快速检出,可有效用于鸭肉中的荧光假单胞菌的快速检测。     

牛肉制品中大豆掺假的荧光PCR鉴别体系的优化

根据常作为"假牛肉"原料或掺入牛肉加工食品中的植物原料——大豆蛋白,设计特异性引物和探针。在确定其高特异性后,对荧光PCR中5个因素即Mg2+终浓度、dNTPs终浓度、Taq酶用量、引物和探针终浓度以及模板DNA用量进行优化。同时测试该方法的灵敏度和优化后的特异性。结果表明该荧光PCR反应可对牛肉及其制品中可能掺假的大豆蛋白进行准确、稳定、快速的鉴定。     

实时定量PCR法对牛肉中鸡源性成份的量化检测

目的实现样品中牛源性成份和鸡源性成份的量化分析。方法通过在基因组单拷贝基因上设计引物,绘制模板DNA扩增标准曲线以及确定牛肉、鸡肉质量与DNA浓度的比值常数,利用实时荧光定量PCR技术对四种不同掺混比例的牛鸡瘦肉混合样本中牛源性成份和鸡源性成份所占的质量百分比含量进行分析。结果通过荧光实时定量PCR反应的Ct值、模板DNA扩增标准曲线和质量与DNA的比值常数可以计算出样品中所含牛源性成份和鸡源性成份的质量百分比含量,检测值与理论值之间的绝对误差可控制在5%以内,量化研究结果基本准确。结论对于组织成份单一的样品,可以通过在基因组单拷贝基因上设计特异性的引物,利用PCR技术实现在质量水平上对食品中动物源性成份的量化分析,该技术方法的建立可以为肉类掺假监管工作提供有力的技术支撑。     

基于高光谱成像的羊肉掺假可视化无损定量检测

目的：快速、准确检测羊肉掺假。方法：利用可见—近红外(400~1 000 nm)和短波近红外(900~1 700 nm)高光谱成像仪对羊肉中掺假不同比例的鸭肉进行数据采集,比较两个波段范围内不同光谱预处理方法的偏最小二乘法(PLS)建模效果,最终在可见—近红外波段选择归一化预处理方法,在短波近红外波段选择标准正态变量变换(SNV)预处理方法。分别对两个波段的光谱数据进行最优的预处理后,采用连续投影算法(SPA)、竞争性自适应重加权算法(CARS)、区间随机蛙跳算法(iRF)和组合区间偏最小二乘法(SiPLS)对特征波长进行选取。结果：在短波近红外(900~1 700 nm)波段采用SNV-SPA-PLS模型的羊肉掺假预测效果最好,预测集决定系数为0.968 4,预测标准偏差为0.058 2,预测集相对分析误差为5.625 4,并得到较好的图像反演结果。结论：利用不同波段的高光谱成像技术可实现对羊肉掺假的快速无损定量检测。     

茶籽油DNA提取方法的比较

针对食用油脂中DNA含量极低、DNA序列片段短、破坏严重的特点,通过实时荧光PCR法检测植物的通用tRNALeu,对茶籽油DNA几种提取方法进行比较,建立了食用油脂中DNA提取新方法。结果证明:较之于文献中常见植物油DNA几种提取方法,用改进方法提取的DNA含量高、纯度高,可以作为PCR反应的模板,为食用油脂进行核酸类生物性检测提供了一种简捷有效的方法。     

小麦和榛子过敏原成分检测的实时荧光PCR方法

过敏原风险问题已成为重要的食品安全问题,如何快速准确地检测出食物中的过敏原成为当前亟需解决的关键。目前常用的过敏原检测方法有免疫学检测、质谱及SPR等技术,但这些方法均有一定程度的局限性。通过引入分子生物学鉴定手段,建立小麦、榛子的过敏原基因数据库,并依据数据库寻找特异性序列并设计探针引物,建立一种快速、便捷、高效的过敏原检测方法,并适当调整了方法的检出限,降低了检测误判的风险。通过建立实时荧光PCR方法,可快速筛选样品的过敏原基因,简化了食品中过敏原成分的鉴定,降低了实验成本与技能要求,降低了检测的难度,缩短了实验时间。通过适用性验证与检出限验证实验,该方法用于过敏原成分鉴定可以达到理想的效果,重复性好,准确率高,检出限为1%。     

驼乳中布鲁氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 建立驼乳中布鲁氏菌的实时荧光PCR快速检测方法。方法 根据布鲁氏菌外膜蛋白omp10基因的碱基序列,设计引物其探针,从模拟布鲁氏菌污染的驼乳中提取布鲁氏菌DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测。结果 该方法从布鲁氏菌M5株中扩增出了特异性目的片段omp10,而对大肠埃希式杆菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过10倍倍比稀释的模板进行检测,该方法的灵敏度为最低可检出2.31×10-4 ng/μL的DNA。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9928,扩增效率E=0.97。结论 建立的实时荧光PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点,为驼乳中布鲁氏菌病的早期预防及流行病学监测提供了有效的技术手段。     

加工方法对猪肉成分RQ-PCR检测结果影响的研究

为评价不同加工处理方法对肉制品猪肉成分实时定量PCR(RQ-PCR)检测结果的影响,研究建立混合肉制品标准品(猪肉质量百分比0.05%~20%),采用5种方法(煮制、微波加热、超声波、烤制、高温高压灭菌)对混合肉制品进行处理,提取肉制品总DNA,采用RQ-PCR扩增线粒体细胞色素b(Cytb),以真核生物18S r RNA为内参,通过△Ctt建立标准曲线并进行相对定量,比较△Ct之间的差异,并由此判断不同加工方法对相对定量的影响,结果显示,不同的加工处理方法均能引起DNA的降解。而通过RQ-PCR检测发现,虽然Ct值随DNA降解程度加深而升高,但△Ct变化较小。因此,△Ct法可作为分析肉制品中猪肉成分的可靠定量手段。     

转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究

为了建立以标记基因为检测靶标的高效定性检测方法,本研究系统地分析了日前申请商业化的转基因植物中标记基因的应用频率,选取了应用频率高或在末来应用潜力大的标记基因neomycin phosphotrarsferaseII （NPTll） ,phosphinothricin acetyltransferase （ PAT）, 5 - enolpyrul - shikimate - 3 - phosphate synthase （ CP4 - EPSPS ） ,phosphlnothricin acetyltransferase （bar） ,hygromycin phosphotransferase H（HPTI1） ,β - glucuronidase （GUS） 和 phospho-mannose isomerase （PMI）作为检测靶标,建立了这七个基因的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。该研究建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高、重现性好,适用于农产品中转基因成分的大规模筛查检测,而且应用实时荧光PCR方法可大大提高检测效率,降低检测过程中样品交叉污染和环境污染的几率。     

基于实时荧光PCR对肉制品中羊肉的精确定量

该研究将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR,r PCR)与微滴式数字PCR技术(micro-droplet digital PCR,dd PCR)相结合,利用dd PCR建立拷贝数和羊肉质量的函数关系,确立了基于r PCR定量检测羊肉含量的方法。特异性实验结果表明,除绵羊和山羊外,非目标物种DNA未出现特异性扩增;灵敏度实验结果表明,该方法的最低检出限为0. 01 ng/μL;通过对已知成分的混合样品和市售样品的检测表明,该方法能够对含量在5%以上的羊肉进行准确定量。因此,该方法在肉制品中羊肉含量检测和掺假鉴别方面具有较好应用潜力。     

快速提取鸭血基因组DNA方法的研究

目的:以鸭血为原料,筛选出高质量、高效率的DNA提取方法。方法:选用4种不同方法提取样品DNA,并建立实时荧光PCR实验,以此鉴别掺假伪劣产品。通过研究DNA质量浓度、提取时间和扩增效果,选取高质量、高效率的提取方法。结果:苯酚/氯仿抽提法提取浓度高、成本低,但步骤烦琐、耗时长,易接触有毒有害试剂;试剂盒法提取DNA纯度较高,但价格昂贵,不适用于大批量样品;核酸提取仪操作简便,但前处理耗时长,适用于大批量产品的检验检测;细胞裂解法操作简单、快速、成本低,因未经后续纯化,所得到的DNA纯度相对较低,但同样满足PCR扩增的检测要求,适用于大批量监督抽查任务。结论:对于大批量的鸭血源性成分检测推荐使用细胞裂解法,但一旦出现阳性样品需要进行复测则需要使用不同的提取方法,以确保实验的准确性。     

NDM-1基因TaqMAN实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据NDM-1序列,设计并合成了PCR检测引物(ND-T-F和ND-T-R)和探针(ND-T-PROBE),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,TaqMAN实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

实时荧光PCR法检测食品和饮料中胡萝卜成分的研究

胡萝卜是一种质脆味美的家常蔬菜,同时也是一种常见的食品过敏原。针对胡萝卜抗冻蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和探针,经验证和条件优化,建立胡萝卜成分的实时荧光PCR检测方法。经实验比较,针对胡萝卜抗冻蛋白设计合成的引物和探针具有相对较高的灵敏性,检测限可达1 ng DNA,而且和常见的食物种类无交叉反应,适于胡萝卜成分的检测。该方法的建立,对于加强食品过敏原的标识管理,保护消费者利益、促进进出口贸易具有重要意义。     

4种方法提取牛肉干DNA的效果比较

目的探求熟肉干制品最佳的DNA提取方案。方法采用4种不同的方法:CTAB法及3种市售试剂盒法,提取11种不同牛肉干样品的DNA,通过对方法的提取耗时,提取DNA的质量及提取DNA用于实时荧光PCR扩增的效果3方面进行比较。结果 TAKARA试剂盒法提取DNA耗时最短仅需要0.5 h,OMEGA试剂盒法提取的DNA的纯度较好,A 260/A 280比值最接近1.8,Tiangen的深加工食品DNA提取试剂盒法提取的DNA做实时荧光PCR的CT值最小,扩增效果最佳。结论 Tiangen试剂盒法对于熟肉干制品DNA的提取效果更为理想。