重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL的构建及鉴定

目的：构建重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL并鉴定,为下一步利用纳米载体介导FL基因移植作用于结肠癌细胞的体内实验奠定基础。方法：应用基因合成和克隆技术构建重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL,并进行酶切鉴定及序列测定,以检测其核苷酸序列与设计是否完全一致。结果：重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL经酶切鉴定分析,琼脂糖凝胶电泳鉴定可见清晰地切出与TRAIL基因大小相符的片段并与DNA marker相符,同时进行序列测定,证实其核苷酸序列与设计完全一致。结论：成功构建重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL并得到正确鉴定,为下一步结肠癌的基因治疗打下实验基础。     

重组质粒pEGFP-c1-FLT3L的构建及鉴定

目的：构建重组质粒pEGFP-c1-FLT3L并鉴定,为下一步利用纳米载体介导FL基因移植作用于结肠癌细胞的体内实验奠定基础。方法：应用基因合成和克隆技术构建重组质粒pEGFP-c1-FLT3L,并进行酶切鉴定及序列测定,以检测其核苷酸序列与设计的是否完全一致。结果：重组质粒pEGFP-c1-FLT3L经酶切鉴定分析,琼脂糖凝胶电泳鉴定可见清晰地切出与FLT3L基因大小相符的片段并与DNAmarker相符,同时进行序列测定,证实其核苷酸序列与设计完全一致。结论：成功构建重组质粒pEGFP-c1-FLT3L并得到正确鉴定,为下一步结肠癌的基因治疗打下实验基础。     

DPC4重组质粒的构建及其对人胰腺癌细胞的抑制作用

目的：构建DPC4基因重组质粒以研究DPC4对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：应用PR-PCR技术扩增出野生型DPC4基因全长cDNA，然后用分子克隆技术构建其真核表达载体，应用脂质体法将DPC4基因导入到人胰腺癌PC-3细胞中，经G418筛选获得可稳定表达DPC4的人胰腺癌细胞，观察DPC4基因对人胰腺癌细胞周期和细胞增殖的影响。结果：获得了野生型DPC4真核表达质粒pcDNA3.1-DPC4，野生型DPC4的导入可引起胰腺癌G1期细胞的增加和S期细胞相应减少，同时抑制细胞生长。结论：野生型DPC4基因具有调节胰腺癌细胞增殖的功能，可作为胰腺癌基因治疗的靶基因。     

风疹病毒E1特异肽段的重组质粒载体构建

目的:构建风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组质粒载体,以期表达RVE1特异肽段的重组蛋白。方法:抽提RV减毒活疫苗Wistar RA27/3株的基因组RNA后逆转录,用PCR方法扩增E1特异肽段的基因片段;扩增产物经纯化后克隆至pGEX-2T质粒载体,挑取重组质粒阳性克隆进行双酶切鉴定和测序。结果:成功克隆出330bp左右的目的片段,重组质粒经测序后与预期序列一致。结论:RVE1特异肽段的基因片段的成功克隆及重组质粒的构建为进一步表达相应重组蛋白奠定了基础。     

MDR1 shRNA表达质粒的构建

Q-ZsGreeen-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreeen-B)经酶切与测序证实两段寡核苷酸片段成功插入到预计位点,序列完全一致,无任何碱基突变. 结论 MDR1 shRNA的表达载体pSIREN-RetroO-ZsGreeen-A和pSIREN-Ret-roQ-ZsGreeen-B成功构建,为进一步研究肿瘤多药耐药逆转奠定了实验基础.     

大鼠Uqcrfs1重组质粒的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的:构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码Uqcrfs1的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定及测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK 293T细胞,使用RT-PCR、Western Blot方法检测重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果:测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfs1的cDNA序列正确;磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因转录与蛋白表达水平,结果达到预期。结论:成功构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达。     

重组端粒酶pEGFP-hTRT质粒的构建

目的 构建具有绿色荧光蛋白报道(GFP)基因的端粒酶真核质粒载体，为转染细胞、延长细胞寿命提供基础。方法 酶切含人端粒酶逆转录酶(hTRT)基因的pGRNl45质粒获取hTRT片段，插入经酶切及磷酸化处理的GFP载体pEGFP—C1，形成8．1kb质粒，经HindⅢ、NotI酶切电泳筛选、鉴定并测序。结果 经酶切电泳分析得到3．4kb及4．7kb大小的两片段；测序结果显示接头两端序列正确。结论 重组竭粒酶pEGFP—hTRT质粒的成功构建，可用于细胞转染，对进一步研究组织工程种子细胞的衰老问题具有重要意义。     

人睾丸前列腺素D合成酶重组表达质粒的构建与鉴定

目的 :构建高效表达人睾丸前列腺素D合成酶 (htL PGDS)的重组表达质粒。　方法 :以经测序证实为人L PGDS的人睾丸L PGDScDNA为模板进行PCR扩增 ,得到编码L PGDS的基因片段 ,用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切后 ,连接到经相同内切酶处理的原核表达载体pGEX 2T中。重组质粒pGEX 2T/htL PGDS被进一步转化感受态大肠杆菌JM10 3 ,转化物接种到含氨苄青霉素的LB平板 ,37℃培养 12～ 16h后 ,挑取氨苄青霉素抗性菌落 ,并接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中 ,37℃、16 0r/min培养 12～ 16h后 ,提取质粒DNA供PCR和双酶切鉴定。　结果 :共筛选出氨苄青霉素抗性菌落 10 9个 ,经PCR和双酶切鉴定出 10个重组质粒pGEX 2T/htL PGDS。结论 :重组表达质粒pGEX 2T/htL PGDS的构建及正确鉴定 ,为以后的重组抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

Rac1基因真核表达质粒的构建及其对结肠癌细胞生物学功能的影响

目的应用分子生物学技术构建Rac1基因真核表达质粒及小分子RNA（siRNA）干扰片段,通过调控其表达,研究Rac1蛋白对结肠癌细胞生物学功能的影响。 方法从结肠癌细胞中扩增Rac1基因,构建pCDNA3.1(+)-Rac1和pEGFP-Rac1真核表达质粒实现过表达Rac1基因;通过小分子RNA干扰抑制Rac1基因表达。利用侵袭实验、划痕实验研究Rac1基因对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的改变;通过Pull-Down实验,研究调控Rac1表达对癌细胞中GTPase活性的影响。 结果成功构建Rac1基因真核表达质粒。通过调控Rac1蛋白的表达证实其与结肠癌细胞中Rac1 GTPase的活化程度,以及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力呈正性关联。 结论通过抑制Rac1的表达,可以有效阻止Rac1 GTPase的激活,从而抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭,为抑制结肠癌进展提供新的干预靶点,也为进一步免疫生物过继治疗提供了必要的实验基础。     

pQE-TGF-β1原核表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

目的：为了解人的TGF-β1基因的功能及生物学活性，制备具有生物学活性的TGF-β1蛋白。方法：用基因重组技术构建pQE30-TGF-β1原核表达载体，并在M15大肠杆菌中进行表达，利用Ni-NTA琼脂柱纯化TGF-β1单体，通过复性得到双体蛋白，利用MTT方法对复性的蛋白进行活性测定.结果：经酶切鉴定及测序结果证明pQE30载体上成功地插入了TGF-β1成熟肽基因片段。pQE30-TGF-β1原核表达载体在大肠杆菌中得到了高效表达，表达量约占全菌蛋白的20％，表达得TGF-β1单体蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳显示均得到了一条蛋白带，分子量为15KD左右。MTT测活证明TGF-β1单体蛋白经复性后具有良好的活性。结论：pQE30-TGF-β1原核表达载体的构建及重组TGF-β1蛋白的制备，为深入了解TGF-β1的生物学功能奠定了基础。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性，了解增强子增强转录效率的能力。方法采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA启动子和增强子序列，先后克隆到含有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体，脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在不同细胞的表达情况。结果成功构建质粒pEGFP—PS—MAPro和pEGFP-PSMAEP，转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的有效表达，且pEGFP—PSMAEP的调控转录能力较pEGFP—PSMAPro强20倍。结论PSMA启动子增强子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性，增强子能够明显增强启动子的转录效率，增加了目的基因的表达水平。PSMA启动子和增强子的共调控可以保证基因表达的强度和细胞特异性，为前列腺癌基因靶向性治疗研究提供实验依据。     

腺瘤性息肉病基因DNA甲基化在食管癌患者肿瘤组织及血浆中的表达

目的 探讨食管鳞癌患者肿瘤组织及外周血游离DNA中腺瘤性息肉病（APC）基因甲基化状态与临床病理特征的关系．以及外周血APC甲基化围手术期的动态变化。方法应用实时定量MSP技术检测76例食管鳞癌患者肿瘤组织、配对的癌旁正常组织以及术前1d、术中及术后7d外周血游离DNA中APC基因的甲基化状态。选取60名年龄性别配对的健康志愿者外周血浆DNA作对照。结果食管鳞癌患者肿瘤组织及外周血游离DNA中APC基因甲基化率分别44．74％（34／76）和42．11％（32／76）,明显高于癌旁组织及健康对照组[（6．58％（5／76）和1．67％（1／60）,均P=0．000]。APC基因甲基化率在外周血与肿瘤组织中具有良好的一致性,其ROC曲线Youden指数为0．849（P=0．000）。APC基因甲基化分别与患者病理分期、淋巴结转移、浸润深度及神经脉管浸润有关（P〈0．05）：家族肿瘤史是与外周血游离DNA中APC甲基化有关的独立因素（P〈0．05）。术前、术中、术后血浆中DNA甲基化发生率呈现先升后降的变化趋势。结论食管鳞癌患者外周血游离DNA中APC甲基化率可反映肿瘤进展状态．并随肿瘤实体的摘除而下降。     

NS2TP基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证

目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因（NS2TP）的转录调节机制。方法应用PCR方法扩增NS2TP的启动子,克隆入pGL4.10载体,构建萤虫素酶报告基因载体,转染HepG2细胞,检测双萤虫素酶活性,验证其转录活性;通过缺失突变法构建系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体。结果成功构建了系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体,分别命名为N1、N2、N3和N4,并确定了N3为NS2TP基因的核心启动子。结论构建NS2TP基因启动子的系列截短报告基因载体,确定了其最小转录活性区域,为进一步研究NS2TP基因的转录活性调节机制奠定理论基础。     

FasL启动子调控的报告基因表达质粒的构建及活性分析

目的扩增FasL启动子并构建带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒,并评价在皮质酮(啮齿类动物体内的糖皮质激素)作用的睾丸Leydig细胞中,由FasL启动子调控的荧光素酶的表达活性。本研究将为进一步分析Leydig细胞中FasL启动子转录调控的作用机制奠定基础。方法采用DNA重组技术构建由FasL启动子调控的荧光素酶报告基因的表达质粒。此重组质粒经阳离子脂质体LipofectAMINE介导,瞬时转染入Leydig细胞中,36h后细胞经皮质酮处理,并于48h时收集细胞。测定荧光素酶的相对表达活性。结果(1)酶切及测序证实成功扩增FasL基因启动子并构建了带有FasL基因启动子的报告基因表达质粒；(2)皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子调控的荧光素酶表达质粒的表达活性显著增高。结论构建成功的带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒可准确地评价FasL启动子在凋亡过程中的作用。     

携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带小鼠白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体,研究肝脏Hepa l石细胞的IDO基因mRNA及蛋白表达情况.方法 酶切含有小鼠全长IDO cDNA的IDO质粒,亚克隆至穿梭载体pAdTrack.ALB上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,生成并筛选阳性克隆,测序、鉴定正确后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,检测病毒滴度,RT-PCR和荧光显微镜鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达.重组腺病毒进一步感染Hepa 1-6细胞,RT-PCR和WesternBlot法分别检测IDO基因在细胞内表达情况.结果 经酶切及测序证实携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,病毒感染滴度为2.9×10~6pfu/ml.感染Hepa 1-6细胞后,RT-PCR和Western Blot可以检测到IDO mRNA水平和蛋白水平表达.结论 构建了携带白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体.     

纳米磁流体-单纯疱疹病毒胸苷激酶重组质粒的构建及其对胃癌细胞增殖的影响

目的 研究hTERT启动子调控下单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)重组质粒的构建、在人胃癌细胞BGC823中的表达及对胃癌细胞BGC823增殖的影响.方法 构建重组质粒pGL3 -hTERT-tk和相应的荧光报告质粒pGL3-hTERT-tk-Luc+;经纳米磁流体PEG-PEI/Fe3O4转染胃癌细胞BGC823,荧光显微镜观察细胞形态变化和转染效率,免疫组织化学(免疫组化)方法检测目的基因在胃癌细胞BGC823中的表达,MTT法检测胃癌细胞BGC823的增殖能力,以上实验均以正常肝细胞LO2为对照.结果 重组质粒pGL3-hTERT-tk构建成功,其长度为1100 bp.荧光素酶标记的阳性、阴性对照及治疗报告质粒pGL3-hTERT-TK- Luc+均能有效转染高表达端粒酶活性的胃癌细胞BGC823,转染效率为(28.1±2.3)％.免疫组化结果显示,重组质粒组胃癌细胞BGC823的细胞质中可见大量HSV -tk基因编码的表达.MTT检测结果示,转染pGL3-hTERT-tk质粒4d后,BGC823细胞增殖受抑制,其A570值为0.254±0.011,低于L02细胞的0.322±0.013;亦低于pGL3-basic-tk转染的BGC823细胞(0.357±0.014)(均P＜0.05).结论 纳米磁流体能将重组质粒pGL3-hTERT-tk转染BGC823细胞并获得表达,PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-tk可显著抑制BGC823细胞增殖,有望成为胃癌基因治疗的新型生物制剂之一.     

U6/H1双启动子siRNA表达框架构建及其对肿瘤细胞端粒酶活性的干扰作用

目的：构建针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子siRNA表达框架（SEC）,并观察其转录产物对HeLa细胞端粒酶活性的干扰作用。 方法：利用融合PCR技术,针对人端粒酶hTERT基因开放阅读区构建3条U6/H1双启动子SEC以及针对其3''端非翻译区构建1条U6/H1双启动子SEC,对各SEC鉴定后,分别转染人宫颈癌HeLa细胞,用端粒重复序列扩增法（TRAP）检测HeLa细胞的端粒酶活性。 结果：4种针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子SEC均成功构建,转染HeLa细胞后,对端粒酶活性的抑制率分别为36.8%、57.39%、80.47%、70.31%。 结论：针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子SEC的成功构建,为开展肿瘤端粒酶基因干扰的实验研究提供了新的有效手段。