遗传性对称性色素异常症一家系基因突变分析

目的 研究发现一家系遗传性对称性色素异常症的致病基因突变情况.方法 收集临床患者家系成员血样并抽提基因组DNA,通过PCR及突变检测致病基因的方法,分析基因的突变位点.结果 该家系患者DSRAD基因12号外显子发生基因突变,表现为第2887位G缺失.结论 该遗传性对称性色素异常症家系患者中存在致病基因突变,表现为碱基缺失.     

人细小病毒B19实验诊断技术研究

目的建立一种快速、准确、特异和定量检测人细小病毒B19的实验检测方法。方法以B19病毒NS1基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,建立对细小病毒B19进行荧光定量检测的实验方法。同时利用荧光定量PCR技术检测本院收集的490例孕妇血清。结果引物与Taqman探针比例为1∶4,镁离子浓度为2.5mmol/L时,反应的本底最低,荧光信号最强。该方法的灵敏度为1.0×101拷贝,有较好的特异性和重复性。检测的490例临床孕妇血清标本,人细小病毒B19DNA阳性为44例,感染率为8.9%(44/490)。结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应,能够准确快速定量检测血清中的人细小病毒B19。     

炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的 快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法 根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物，扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子，从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定，生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物，可以扩增出长2205bp的保护性抗原基因，经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段，对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论 利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

临床高毒力致泻性沙门氏菌快速检测方法的初步建立

目的 沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌,对公众的生命健康和财产安全造成重大危害。基于此,我们拟建立并验证一种基于多重PCR结合分子标记探针的检测方法用于快速筛查临床高毒力致泻性沙门氏菌,旨在指导临床快速甄别由高毒力沙门氏菌引起的感染,及时采取治疗措施,降低患者负担。方法 对沙门氏菌基因组生物信息学分析后选择沙门氏菌中高保守的invA、常见毒力因子pagC基因及肠毒素编码基因stn作为检测靶点,每个靶点分别设计3套备选引物和探针,进行梯度PCR筛选得到扩增效率最佳的引物对和探针(invAF、invAR、invAP,pagCF、pagCR、pagCP,stnF、stnR、stnP)。收集40株分离自临床患者标本的沙门氏菌进行灵敏度分析,选择沙门氏菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、产期肠杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、鲍曼不动杆菌、粘质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌共12种临床常见细菌用于特异性验证。采用磁珠法抽提基因组DNA,将浓度稀释至10^-2μg/ml用于特异性验证,将沙门氏菌基因组DNA进行倍比稀释,用于灵敏度验证。结果 经验证,in...     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物，制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针，以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针，将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记；将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

单核细胞增生李斯特菌hlyA基因实时荧光PCR的建立与研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌hlyA基因TaqMan探针实时荧光PCR,用于食品卫生检验的快速筛查。方法根据单核细胞增生李斯特菌hlyA基因设计特异的引物与TaqMan探针,建立和优化实时荧光PCR反应体系,评估其特异性、灵敏度、稳定性,并在食品卫生检验中与细菌分离方法同步应用比较。结果建立了单核细胞增生李斯特菌TaqMan探针实时荧光PCR反应体系,经优化其最佳退火/延伸的温度为58°C,25μL反应体系中上、下游引物和探针最佳终浓度配比分别为0.7、0.7、0.4μmol/L;该实时荧光PCR反应体系可在35 min内完成检测,与沙门菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌等16种非目标菌无交叉反应,对阳性克隆质粒的检测下限可达100拷贝/μL的稀释梯度,对同一核酸浓度样本20次检测的Ct值变异系数为0.46%;在对120份食品安全风险监测标本的快速检测应用中,6份标本单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR扩增阳性,从相应样本中分离出6株单核细胞增生李斯特菌,实时荧光PCR与分离培养方法检测结果相一致。结论针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因建立的TaqMan探针实时荧光PCR具有快速、特异、灵敏、稳定等优势,可用于食品卫生检验中单核细胞增生李斯特菌的快速、高效筛查。     

5种常见念珠菌反向斑点杂交技术的研究

目的建立白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌的反向斑点杂交诊断技术。方法针对念珠菌ERG11保守基因设计引物和杂交探针,对探针进行标记然后固定在尼龙膜形成一种杂交膜,将PCR产物点样在杂交膜进行斑点杂交,显色。结果通过通用引物扩增五种常见念珠菌DNA片段,大小为350bp。构建了5种念珠菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高。结论本研究建立的反向斑点杂交技术可快速、准确地鉴定临床常见念珠菌,有望在临床微生物诊断中广泛应用。     

N-ras基因DNA损伤检测方法的建立

目的 建立应用依赖随机化末端连接物PCR（RDPCR）技术检测N—ras基因DNA损伤的试验方法。方法 采用单引物PCR技术制备N—ras基因外显子1单链探针,酶切构建DNA损伤模型,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色。结果 单引物PCR技术制备单链探针获得成功,目的基因在相应位置出现了清晰的杂交条带。结论 RDPCR技术可定位检测到该酶切DNA损伤位点,表明该方法已成功建立,将有利于其在化学致癌作用机制研究及肿瘤预防领域的应用。     

微滴式数字PCR(ddPCR)快速检测α珠蛋白基因αααanti-3.7三联体

目的 建立一种基于微滴式数字PCR(ddPCR)技术的α珠蛋白基因αααanti-3.7快速检测方法.方法 以β-actin为参比基因、a1基因X1/Y1盒之间的差异性序列为目的基因代表性扩增子,设计特异性引物和TaqMan探针,建立基于ddPCR技术的拷贝数定量方法;检测28例已知基因型和60例临床样本,评价此方法的灵敏度和准确性.结果 采用本研究建立的方法,28例已知基因型样本的检测结果均与靶基因型结果相符;60例临床样本中检出5例αα/αααanti-3.7,与MLPA的验证结果一致;方法学评价结果显示此ddPCR体系的灵敏度与准确性均达100％.结论 建立了一种α珠蛋白基因aaαanti-3.7三联体ddPCR检测方法,操作简单快速、结果准确可靠,可应用于人群筛查和临床常规分子诊断.     

连接酶链反应结合荧光PCR法检测UGT1A1*28基因多态性

目的: 建立一种连接酶链反应结合荧光PCR的方法,检测结肠癌患者外周血UGT1A1*28基因多态性,并探讨其临床应用价值。方法: 设计连接酶荧光PCR引物和探针,首先通过连接酶反应,然后结合荧光PCR技术检测UGT1A1*28基因多态性,构建标准品评判该体系的特异性和敏感性,并检测50例结肠癌患者外周血标本,与DNA测序进行平行比较。结果： 此方法能准确地区分UGT1A1*28基因TA6/6、TA7/7及TA6/7基因型,且最低可检测5 ng人基因组DNA, 50例结肠癌患者外周血标本的检测结果与测序结果一致。 结论： 连接酶链反应结合荧光PCR可准确检测出UGT1A1*28基因多态性。     

炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物,扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子,从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定,生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物,可以扩增出长2 205 bp的保护性抗原基因,经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段,对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌方法的建立

目的建立双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。方法在Gen Bank数据库查找序列并比对后设计tdh和vvh A基因引物和探针。对PCR反应退火温度、引物、探针、Mg2+、Taq DNA聚合酶及d NTPs浓度进行优化,确定反应体系和反应条件,并对新建方法的特异性、灵敏度等方面进行分析,对模拟样品进行检测。结果建立了双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。该方法的特异性较好,检测限为103 CFU/ml。结论建立的双重荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地检测副溶血性弧菌和创伤弧菌。     

使用PCR-SSP方法检测HLA-DR4抗原

目的：采用顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)建立人类白细胞抗原DR4位点的DNA分型方法。方法：合成特异性引物，组成PCR反应用于DR4位点，建立一步法PCR-SSP。结果：所有样本PCR-SSP基因分型获得成功，分型结果经标准DNA，限制性核酸内切酶分析证实符合，特异性和重复性100％。结论：PCR-SSP检测HLA-DR4的方法具有快速，准确，特异性高等优点，适合临床应用。     

PCR-ELISA检测TB DNA方法的建立及其初步应用

目的 建立灵敏，快速，特异的PCR-ELISA检测结核菌DNA的方法。方法 用一对生物素标记的上游引物和未标记的下游引物对TBIS6110的一段DNA进行快速PCR扩增，使扩增产物的一条链上带有生物素，同时PCR反应液中存在有地高辛的标记的检测探针，随着PCR的结束，探针与生物素标记的扩增产物形成特异的杂交体，该杂交体通过链霉亲和素被固定在微孔板表面，然后用标记有过氧化物酶的地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合，漂洗后加底物显色。测定吸光度值（A450nm)。结果 该方法灵敏，特异，快速，可以检测出10copies的模板量，对临床60例痰标本进行培养法。结论 该方法适用于临床进行快速的TB基因检测，也可用于其它病原体的检测。     

Taqman荧光PCR技术在地沟油猪源性成分检测中的应用初探

目的:建立Taqman荧光PCR猪源性成分检测技术,并将其应用于地沟油检测。方法:利用直接沉淀DNA法提取油样DNA,以猪线粒体细胞色素b基因序列设计特异的引物和探针,在对引物和探针进行特异性和敏感性评价的基础上建立Taqman探针PCR方法,对地沟油、猪油、市售可疑油脂等油样进行检测。结果:该系统能够对目的基因进行特异性扩增,不与其他物种发生交叉反应,能够定量检出0.001ng的模板;可以检测出地沟油、猪油中的猪源性成分,并经动物源性基因PCR鉴定确证阳性结果的可靠性。结论:本研究所采用的Taqman荧光PCR技术可以扩增出地沟油中的猪线粒体细胞色素b(Cyt b)基因,得到阳性的结果,将可用于地沟油的检测。     

金黄色葡萄球菌反向线性杂交探针检测方法的建立

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌的简单、快速、灵敏、准确的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc 基因,设计一对通用引物及两条特异性探针,用生物素标记通用引物的5′端,将两条特异性探针固定于硝酸纤维膜上,使PCR产物与探针杂交。结果建立的反向线性杂交探针方法,其检测限为2 ng/μL,检测特异性和准确性均为100%。结论建立的反向线性杂交检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测。     

多探针荧光定量PCR法用于慢性前列腺炎病原菌学诊断的建立

目的建立一种新的改良的TaqMan荧光定量PCR方法，能高度敏感地同时检测并鉴定多种细菌．该方法有一套独特的多探针设计：一对由16SrDNA基因编码的高度保守序列作为引物；引物之间的一个高度保守区域被用来设计通用探针，一个高度可变区域被用来设计特异性探针．方法通过对10种慢性前列腺炎病人细菌培养常见的病原菌的DNA提取物进行FQ-FCR（荧光定量PCR）检测，用通用探针检测这10种细菌的DNA含量，在此同时用金黄色葡萄球菌特异性探针（SA probe）和大肠杆菌特异性探针（EC probe）分别特异性检测金黄色葡萄球菌（S．aureus）和大肠杆菌（E．coil）的DNA含量．[第一段]     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

遗传性对称性色素异常症一家系中ADAR基因的新突变

目的 研究遗传性对称性色素异常症的RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)基因的突变.方法 调查一个遗传性对称性色素异常症家系,采集该家系中患者及正常人血样,用聚合酶链反应扩增ADAR基因,并对扩增产物进行直接测序,找到其突变位点.同时在其突变位点附近设计等位基因特异PCR引物,对该家系中的患者及40名无血缘关系健康对照者的该位点进行扩增电泳对比,以确认是突变而不是多态性.结果 该家系中所有患者存在ADAR基因3号外显子c.1642的缺失,导致移码突变(p.P548fsX563).结论 该家系发病是由ADAR基因c.1642 delC突变所致.     

五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .