磁珠分离DNA技术检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变

HIV-1逆转录酶基因突变导致的耐药性严重影响了药物对病人的治疗效果,耐药性突变的检测对于指导合理用药具有重要意义。本工作发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。在两步MS-PCR方法的基础上,引入磁珠分离DNA技术并结合酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测逆转录酶基因耐药性突变T215F和Y181C。结果显示： MS-PCR结合磁珠分离技术和ELISA具有较高的灵敏度和特异性,阳性/阴性比值（P/N值）达到要求,突变型模板检测限为5%左右,耗时短且能进行高通量检测。无论在HIV-1耐药性突变还是其它的点突变检测中,该方法都具有较好的临床应用前景。     

端粒酶逆转录酶基因的结构特点及转录调控

调节端粒酶活性的最主要成份是端粒酶逆转录酶（hTERT) ,它往往在肿瘤发生的早期巳表达,故对其研究具有重大的临床意义,近年hTERT基因启动子区巳克隆鉴定,研究发现在其核心启动子区含有多个转录因子结合位点,体内外的转录因子结合在这些位点和“CPG岛”甲基化、组蛋白去乙酰化以及hTERT转录变异体的自身调节等构成了对hTERT基因转录调控的复杂系统。研究hTERT基因的转录调控将对肿瘤的发生发展、诊断和治疗提供重要的帮助。     

凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因和粘附基因检测及耐药性分析

目的了解凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）耐药基因和粘附基因的分布及其耐药性情况。方法收集45株凝固酶阴性葡萄球菌临床分离株,采用PCR检测其耐药基因mecA和粘附基因c弘知如B,并分析其耐药性。结果（1）凝固酶阴性葡萄球菌中mecA、cva、fn6pB的阳性率依次为86．7％（39／45）、11．1％（5／45）、71．1％（32／45）。（2）凝固酶阴性葡萄球菌中耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCoNS）的检出率为88．9％,对β-内酰胺类抗生素的耐药率都在80％以上,对利福平、左氧氟沙星、林可霉素的耐药率较低,未发现对万古霉素、利奈唑胺耐药菌株。结论CoNS中MRCoNS检出率很高,对常用抗生素耐药率高,且有一定的粘附能力,临床上应该根据药敏试验结果慎重及合理的使用抗生素。     

用分子模拟方法研究HIV-1整合酶突变体的耐药性机理

二酮酸类化合物(DKAs)是目前最有前景的HIV-1整合酶(integrase, IN)抑制剂．为了解DKAs引起的多种耐药株共有的耐药性机理,选择3种S-1360引起的IN耐药突变体,用分子对接和分子动力学模拟,研究了野生型和突变型IN与S-1360的结合模式,基于该结合模式探讨了3种耐药突变体所共有的耐药性机理．结果表明：在突变体中,S-1360结合到耐药突变IN核心区中的位置靠近功能loop 3区却远离与 DNA结合的关键残基,结合位置不同导致S-1360的抑制作用部分丧失;残基138到166区域的柔性对IN发挥生物学功能很重要,S-1360能与DNA结合的关键残基N155及K159形成氢键,这2个氢键作用降低了该区域的柔性,突变体中无类似氢键,因而该区域柔性增高;在突变体中,S-1360的苯环远离病毒DNA结合区,不能阻止病毒DNA末端暴露给宿主DNA;T66I突变导致残基Ⅰ的长侧链占据IN的活性口袋,阻止抑制剂以与野生型中相同的方式结合到活性中心,这均是产生抗药性的重要原因．这些模拟结果与实验结果吻合,可为抗IN的抑制剂设计和改造提供帮助．     

食物链中抗生素耐药性基因的转移

抗生素的使用,一方面起到预防和治疗疾病的作用,另一方面,饲料、食品和环境中抗生素残留增加,使抗生素耐药性菌产生并进化,从而导致将来治疗某些疾病时无有效抗生素可用,比如,结核病已经卷土重来,而且现在就有许多患者就不能用抗生素治愈。随着人们生活水平的提高,安全、健康问题受到人们广泛的关注和重视。本文初步对耐药性基因在食物链中怎样产生和转移进行综述。     

葡萄球菌多重耐药性的基因位点分析

目的:分析皮肤伤口化脓病人脓液中检出的15株葡萄球菌耐药基因定位。方法:用麦康凯平板选取可疑菌落,通过触酶、葡萄糖甘露醇分解、高盐耐受、血浆凝固酶、新生霉素敏感等试验鉴定细菌;药敏试验采用K-B法。结果:共检出了葡萄球菌15株,其中金黄色葡萄球菌12株,占80%;表皮葡萄球菌3株,占20%。用5种药物做了药敏试验,并进行了质粒消除和转化试验。结论:78.3%的耐药基因由质粒编码,21.7%的耐药基因由染色体编码,这也解释了葡萄球菌耐药性迅速扩散的原因。     

鲍曼不动杆菌的耐药性检测及泛耐药菌株的耐药基因研究

目的考察临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药性并对泛耐药菌株的耐药基因进行检测。方法用纸片扩散法对60株临床分离鲍曼不动杆菌进行药物敏感试验,并用PCR法检测8株泛耐药菌株携带7种耐药基因OXA-51、OXA-23、OXA-24、OXA-58、aac(3)-Ⅰ、gyr A、abe M的情况。结果所分离的鲍曼不动杆菌对临床常用的β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、磺胺类抗菌药及喹诺酮类抗菌药均产生耐药性;在8株泛耐药鲍曼不动杆菌中OXA-51、OXA-23、OXA-58、gyr A、abe M基因检测均全部呈阳性;OXA-24基因检测均呈阴性;aac(3)-I基因检测有5株呈阳性,3株呈阴性。结论鲍曼不动杆菌耐药情况严重,其耐药机制与多种耐药基因密切相关。     

人巨细胞病毒基因突变与耐药性的相关性研究进展

人巨细胞病毒是人群中感染非常广泛的一类病毒,近年来其感染引发的严重疾病日益增加.为了预防和控制该痰病,须反复长期使用抗病毒药物,从而导致该药耐药性的出现.本文介绍了巨细胞病毒基因突变与耐药性的相关性研究进展,结合药物的作用机制和病毒的结构特点对人巨细胞病毒的主要耐药突变区域UL97基因和UL54基因的突变位点进行了统计分析,提出了耐药突变的高发区域,对进一步研究耐药蛋白空间结构的变化及新药的研制有重要的指导意义.最后对交又耐药的研究进行了分析综述,对耐药人巨细胞病毒的研究方向及关注的问题提出了自己的看法.     

头孢西丁耐药肺炎克雷伯菌AmpC基因和ESBLs检测及耐药性分析

目的了解深圳地区头孢西丁耐药肺炎克雷伯菌头孢菌素酶(AmpC酶)基因型分布、产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的情况及其耐药特点。方法收集深圳地区三家大型综合医院临床标本分离对头孢西丁耐药的肺炎克雷伯菌73株。用碱裂解法提取菌株的质粒,采用多重PCR扩增AmpC基因,应用DNA测序确定其基因型。并对所有菌株进行ESBLs表型确证试验;用K-B法对其进行药物敏感试验。结果 48株(65.8%)AmpC基因扩增阳性,经DNA测序显示,其中46株为DHA-1型,1株为CMY-2型,1株同时产DHA-1和CMY-2型;73株肺炎克雷伯菌中49株ESBLs阳性,其中36株AmpC基因和ESBLs均为阳性。AmpC和(或)ESBLs阳性菌株对多数药物的耐药率高于AmpC和ESBLs均阴性者。结论本地区头孢西丁耐药肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶检出率高,基因型主要为DHA-1,同时产AmpC酶和ESBLs菌株较常见。     

Epistasis among Deleterious Mutations in the HIV-1 Protease

A central goal in molecular evolution is to understand how genetic interactions between protein mutations shape protein function and fitness. While intergenic epistasis has been extensively explored in eukaryotes, bacteria, and viruses, intragenic epistatic interactions have been insufficiently studied. Here, we employ a model system in which lambda phage fitness correlates with the enzymatic activity of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease to systematically determine the epistatic interactions between intragenic pairs of deleterious protein substitutions. We generated 114 genotypes of the HIV-1 protease, each carrying pairs of nucleotide substitution mutations whose separated and combined deleterious effects on fitness were then determined. A high proportion (39%) of pairs displayed lethality. Several pairs exhibited significant interactions for fitness, including positive and negative epistasis. Significant negative epistatic interactions predominated (15%) over positive interactions (2%). However, the average ± SD epistatic effect, ē = 0.0025 ± 0.1334, was not significantly different from zero (p = 0.8368). Notably, epistatic interactions, regardless of epistatic direction, tend to be more frequent in the context of less deleterious mutations. In the present study, the high frequencies of lethality and negative epistasis indicate that the HIV-1 protease is highly sensitive to the effects of deleterious mutations. Therefore, proteins may not be as robust to mutational change as is usually expected.     

双抗体夹心ELISA检测HIV-1 gp41抗原方法的建立

目的:建立检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA,并探讨其临床应用的可行性。方法:用饱和硫酸铵(SAS)纯化抗HIV-1gp41-5单克隆抗体(mAb),用HRP标记后建立双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测,并用该方法对40份HIV-1阳性血清进行了检测。结果:用mAbE12(5μg/mL)为包被抗体,2H6为酶标记抗体(1∶900)建立了双抗体夹心ELISA法,检测gp41-5多肽的灵敏度是100pg/mL。对HIV-1阳性血清中gp41抗原的检出率为67.5%(27/40)。结论:建立了特异性强、灵敏度良好的检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。     

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load >1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads <1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.     

HIV-1包膜基因变异的体外研究

采用亚型测定、核苷酸和氨基酸序列测定和同源性分析等方法,观察了HIV-1 ⅢB毒株在实验室长期传代过程中包膜基因变异的情况.研究的毒株包括:经过实验室8年多连续使用而获得的毒株、在MT4细胞长期连续传代而获得的每间隔10代的毒株样品及多次更换宿主细胞传代而获得的毒株.主要结果有:(1)各种毒株包膜基因变异均不显著,核苷酸序列同源性均大于92%,变异距离均小于7.5%,且随着传代数增加核苷酸趋于稳定,代间同源性由92%上升至99%,而变异距离由7.5%下降为0.6%.(2)在传代过程中HIV-1亚型保持稳定,各种毒株均为HIV-1 B3亚型.结果显示HIV在体外长期传代培养的过程中变异不大,遗传性状稳定,可能是体外生长的环境十分稳定,缺乏机体免疫学压力.结果也提示体外长期传代HIV毒株仍然适用于各种HIV的应用研究,用长期传代的方法发展HIV-减毒活疫苗的可能性不大.     

HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的比较

目的由于检测SIV p27抗原试剂盒来源困难,有时不稳定,鉴于HIV-1 p24与SIVp27有较强的交叉抗原,本研究比较HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原得出的结果是否存在一定的相关性。方法 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒定性和定量检测样品中SIV p27抗原,并对检测结果进行回归和相关分析。结果 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的灵敏度分别是150 pg/mL和62.5 pg/mL。两种试剂盒检测病毒液和血浆中SIV p27抗原的定性结果一致。定量结果的统计分析得出病毒液的直线回归决定系数R2=0.857,直线相关系数r=0.926,P〈0.01,直线正相关程度较高;血浆的直线回归决定系数R2=0.512,直线相关系数r=0.716,P〈0.05,直线正相关程度较低。结论 HIV-1 p24 ELISA试剂盒能够替代SIVp27 ELISA试剂盒定性检测病毒液和血浆中SIV p27抗原,但只能定量检测病毒液中SIV p27抗原。     

HIV-1整合酶蛋白的可溶性表达及功能研究

HIV 1整合酶是HIV病毒复制中一个重要的酶,也是治疗艾滋病药物的一个重要靶点。为了开展以整合酶蛋白为靶点的抑制剂筛选,构建HIV 1整合酶重组质粒,在原核细胞中进行可溶性表达和功能研究。通过重叠PCR技术引入F185K和C280S突变于HIV 1 B亚型标准株的整合酶cDNA片段中,PCR扩增片段克隆到pET 28a(+)表达载体中,构建重组质粒,在E. coli中进行整合酶基因表达,SDS PAGE鉴定表达产物,亲和层析纯化蛋白,酶联免疫吸附实验方法测定整合酶的生物学活性。结果构建的重组质粒获得高效稳定的可溶性表达,ELISA实验证实该蛋白具有整合酶的3′切割DNA和5′链转移的活性。HIV 1整合酶蛋白的可溶性表达和活性研究为建立以整合酶为靶点的抗HIV药物筛选平台打下了基础。     

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-1 gag基因,并与真核表达载体pCI-neo连接,构建含有中国流行株HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.经XbaⅠ/SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.通过脂质体将pCI-neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物.结果表明所构建的HIV-1 核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础.