龙眼体胚发生过程中特异蛋白的IEF和SDS-PAGE分析

植物体细胞胚胎发生的机理研究是目前植物细胞工程的前沿和优先发展领域 [1] .体细胞胚胎发生被认为是分离胚胎发育相关基因的良好替代体系 ,同时 ,进行体细胞胚胎发生研究对于研究植物细胞全能性的机制、基因的表达和胚胎的发育具有重要意义 [2 ] .龙眼 ( Dimocarpuslongan Lour.)是我国南方的重要热带、亚热带特产果树 .在龙眼上已建立了木本植物中最为优良的体细胞胚胎发生系统 [3 ,4] .体细胞胚胎与合子胚在生化上具有相似性 .蛋白质是基因表达的产物 ,而体细胞胚胎发生是胚胎发生相关基因按一定时空顺序表达的结果 .在体细胞胚胎发生…     

龙眼体细胞胚胎发生过程中特异表达蛋白的双向电泳分析

以龙眼品种红核子LC2胚性细胞系为材料,进行体细胞胚胎(简称体胚)发生及其同步化调控,获取体胚发生过程中各个主要发育阶段的培养物(胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚、早期成熟胚、中期成熟胚、晚期成熟胚),采用双向电泳对体胚发生过程中特异表达蛋白进行分析.结果表明:(1)龙眼胚性愈伤组织中,pI为4-5的酸性蛋白表达种类最多,在体胚发育的过程中逐渐消失,相反,pI为5-6的微酸性蛋白的表达逐渐增多;(2)体胚发育后期,尤其是成熟胚晚期,分子质量大的蛋白大量减少,分子质量较小的蛋白增多并逐渐积累;(3)虽然在各个发育阶段都会出现一些新的特异蛋白,但是没有改变蛋白质种类逐渐减少的趋势;(4)发现了一些有差异的特异蛋白点,尤其是成熟胚后期,有一系列大分子质量的蛋白消失,新出现了一部分分子质量较小的蛋白,其中几种表达量很大,可能与体胚发育有密切关系.     

龙眼体胚Obg1基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

本试验克隆了龙眼体胚Obg1基因(DLObg1)的3个转录本.序列分析表明,DLOBG1蛋白具有典型的OBG蛋白结构域,与其他植物的OBG蛋白具有较高的同源性,与葡萄、蓖麻和玉米的氨基酸序列同源性分别为84%、84%和82%.实时荧光定量PCR分析显示,DLObg1基因的转录水平随龙眼体胚的发育而变化,在心形胚和鱼雷形胚阶段的表达量最高,可能与子叶等器官的形成有关.     

龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达

以龙眼体胚发生早期的胚性培养物为材料,通过简并引物结合PCR进行cDNA末端快速克隆(RACE)的技术,克隆到了龙眼体胚相关未知蛋白基因DlUP-5全长序列,其cDNA全长为887 bp,由681个核苷酸组成的开放阅读框,编码226个氨基酸(GenBank登陆号为GQ443759).该基因推导的蛋白分子质量为24511.9 u,理论等电点pI为9.65;该蛋白是Frigi-da-like蛋白质家族成员,是一个具有Frigida组件,无典型信号肽结构,无跨膜螺旋的亲水性蛋白;不规则卷曲是其最大量的结构元件,并且主要集中在C端区域.实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达,呈"N"形趋势,其中以不完全胚性紧实结构阶段最高,而鱼雷形胚阶段表达量最低;方差分析表明,鱼雷形胚阶段DlUP-5基因表达量与其他7个阶段存在极显著差异.该研究结果对DlUP-5基因在龙眼体胚发生过程中的作用有了一个初步的认识,其在龙眼胚性愈伤组织胚胎发生能力、早期体胚正常发育和体胚成熟过程等方面可能起重要作用.     

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。     

龙眼胚性愈伤组织体胚发生同步化调控及组织细胞学观察

以龙眼“红核子”胚性愈伤组织为材料 ,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控 ,并采用石蜡切片进行组织形态学观察 .结果表明 ,通过控制培养基中 2 ,4-D质量浓度可以调控龙眼体胚的发育进程 ;龙眼胚性愈伤组织的胚胎发生一般是内起源 ,且起源于单细胞     

龙眼体胚发生中期发育同步化的初步调控

试验以龙眼"红核子"胚性愈伤组织为材料,对龙眼体细胞胚胎发生进行同步化调控,2,4-D浓度为0.07mg/L时获得了心形胚,2,4-D浓度为0.05mg/L和0.06mg/L时获得了鱼雷形胚,2,4-D浓度为0mg/L时获得了高度同步化的子叶形胚。研究表明,通过培养基中2,4-D浓度的微量调整,基本能够控制龙眼体胚发育中期心型、鱼雷形胚的发育同步化。     

龙眼胚性愈伤组织微管蛋白基因β-tubulin克隆及序列分析

以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,利用RT．PCR法首次克隆2条含有完整开放阅读框的β-tubulin基因的cDNA序列,命名为dl-β-tubu／in3和dl-β-tubulin6,长度分别为1350和1351bp,均编码含有446个氨基酸残基的蛋白质．生物信息学分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域;与毛果杨、大豆、水稻、玉米和拟南芥具有较高的同源性;含有微管蛋白所特有的2个保守结构域NNWAKGH和RKAFLHWYTGEGMDEMEnE,以及1个GTP结合位点GGGTGSG．推测β-tubulin通过不同的磷酸化方式改变酶活性及蛋白构象,参与龙眼体胚发生过程的调控．     

龙眼胚性愈伤组织LEC1基因cDNA克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织Leafy Cotyledon 1(LEC1)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(简称体胚)发生过程中的表达情况.采用RT-PCR结合RACE法及TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织LEC1基因的cDNA全长序列,运用生物信息学方法对该序列...     

龙眼体胚发生过程中的RNA研究初报

龙眼 ( Dimocarpus longan L our.)属无患子科 ( Sapindaceae)龙眼属 ,是起源于我国的一种重要热带、亚热带木本果树 .近 1 0多年来 ,赖钟雄等在前人 [1 ]的研究基础上 ,建立了龙眼体细胞胚胎高频率发生系统 ,这是在木本植物中最为优良的体胚发生系统之一 ,可作为木本植物体胚发生的模式系统 [2 - 6] .植物的体细胞胚胎发生的机理研究是目前植物细胞工程的前沿和优先发展领域 [7- 8] ,对于研究植物细胞全能性的机制、基因的表达和胚胎的发育具有重要意义 ;同时 ,由于体细胞胚胎发生过程与合子胚胎类似 ,即类似的分子机制调控着在体内 ( in…     

龙眼胚性愈伤组织AGO6基因克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

依据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,利用RT-PCR结合RACE技术,以龙眼胚性愈伤组织c DNA为模板,获得Dl AGO6基因的c DNA全长序列,共3 168 bp(登录号为KF819529),完整开放阅读框2 700 bp,编码900个氨基酸。生物信息学分析表明:Dl AGO6的c DNA所编码的氨基酸序列含有2个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与拟南芥AGO6蛋白序列有较高的同源性。龙眼体胚发生过程中Dl AGO6表达量的q PCR分析表明:Dl AGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织时期的表达量最高,在鱼雷形胚时期表达量最低,推测DLAGO6在龙眼松散型胚性愈伤组织阶段的高表达量,可能与细胞的旺盛分裂有关。     

龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组学

【目的】通过龙眼（Dimocarpus longan Lour.）体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质组学研究,为植物胚胎发育相关蛋白基因分离和植物体细胞胚发生相关机制等的深入研究奠定基础。【方法】利用已建立的龙眼体细胞胚发生再生系统,经同步化培养获得龙眼体细胞胚发生早期5个阶段胚性培养物,并采用双向电泳和质谱技术对龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组变化进行分析。【结果】龙眼体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质2D表达谱可检测到1 203-1 798个蛋白点,其在龙眼体细胞胚发生早期各阶段大部分具有阶段差异表达特性,有小部分是阶段特异表达,根据其蛋白数目、表达丰度、分子量和等电点等变化,确定了龙眼体细胞胚发生早期的ECII到CpECGE阶段是体细胞胚发生早期的关键性阶段。成功鉴定45个差异蛋白,成功率为37%,其中以能量、碳水化合物代谢相关蛋白和氧化胁迫反应相关蛋白占多数,分别为22%和27%;通过其功能分析可以推断出,龙眼体细胞胚发生早期,能量和糖代谢是体细胞胚发生的基础,而氧化胁迫反应是体细胞胚发生的先决条件,并通过参与细胞骨架的稳定、氮代谢、信号转导、基因调控、蛋白质的翻译加工修饰和定位等功能的蛋白,构成一个庞大的龙眼体细胞胚发生蛋白质调控网络系统,保证体细胞胚的正常发育。【结论】对龙眼体细胞胚发生早期过程的蛋白质表达变化有了较全面的了解,蛋白质表达数量呈先减低后升高再减低的趋势,龙眼体细胞胚发生早期能量和糖代谢旺盛,氧化胁迫反应相关蛋白对体细胞胚早期的发生和发育有重要的调控作用。     

龙眼体胚成熟过程中淀粉含量的变化

研究了光照条件、蔗糖含量、聚乙二醇(PEG6000)、脱落酸(ABA)及椰乳等因素对龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化的影响.结果表明:在光照低糖(质量分数为2%,下同)、光照高糖(质量分数为5%,下同)、黑暗低糖加PEG6000的作用下,龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化相似,整个成熟过程中呈单峰型;在黑暗低糖、黑暗低糖加ABA、黑暗高糖加ABA、黑暗高糖加椰乳作用下,龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化呈双峰型.在黑暗和高糖作用下且经历正常成熟的体胚中淀粉含量变化也很相似,总趋势都是上升的.     

金花茶多酚氧化酶基因的克隆及其体胚发生过程中的表达分析

以金花茶胚性培养物为材料,对体胚PPO基因克隆以及在体胚发生过程中的转录水平进行q PCR分析和酶活性变化检测.结果表明:克隆获得的金花茶PPO基因c DNA序列1788 bp,含有完整的开放阅读框(ORF),编码595个氨基酸;与登录Gen Bank的山茶属其他植物PPO基因序列进行核苷酸和氨基酸比对发现,同源性分别为74%和72%左右.同时,以18S rRNA作为内参基因进行的q PCR分析表明:金花茶体胚发生过程中PPO基因表达量呈下降趋势,球形胚PPO基因表达量最大,子叶胚和心形胚次之,成熟胚最小;而正常子叶胚和花状多子叶胚的表达量存在明显差异.此外,对金花茶体胚发生过程中PPO活性变化检测结果表明:在此过程中PPO活性明显比较低,变化趋势与PPO基因定量表达结果相似,推测PPO基因可能在金花茶体胚发生早期发挥重要作用.     

龙眼肉中9种核苷类成分的高效液相色谱分析

利用高效液相色谱(HPLC)法同时分离测定了龙眼肉中的9种核苷类成分(尿嘧啶、胞苷、尿苷、胸腺嘧啶、次黄嘌呤核苷、鸟苷、胸苷、腺嘌呤相对标准偏差和腺苷)。分离柱为Nucleosil C18反相柱(250 mm×4 mm),流动相为0.01 mol/L的KH2PO4和甲醇,梯度洗脱,流速1 mL/min,检测波长260 nm,柱温40℃。用外标法测定龙眼肉中9种核苷成分的含量。在供试条件下,选取9种核苷标准品的线性范围为0.05~3.20μg/mL,相关系数r=0.9999~1.0000;标准品在0~48 h内经多次测定,保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.133%~1.156%和1.153%~3.023%;回收率和回收率相对标准偏差分别为98.79%~107.34%和1.411%~4.544%;仪器最低检出限分别为0.0035~0.0136μg/mL。