谷氨酸触发大鼠大脑皮质神经元Ca~(2+)内流与PTK的关系

目的　研究谷氨酸 (glutamate,Glu)触发大鼠大脑皮质神经元Ca2 + 内流特性 ,蛋白酪氨酸激酶 (PTK)抑制剂genistein及蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTP)抑制剂vanadate对其影响 ,揭示PTK与Glu触发大鼠大脑皮质神经元Ca2 + 内流的内在联系。方法　采用Fura 2 /AM荧光测定胞浆Ca2 + 变化技术 ,在原代培养的大鼠大脑皮质神经元上观察药物对Glu触发Ca2 + 内流的影响。结果　Glu触发的Ca2 + 内流不受电压依赖性钙通道 (VDCC)阻断剂尼莫地平影响 ,亦不受非VDCC阻断剂SK&F96 36 5影响 ,但可被PTK抑制剂genis tein抑制 ,被PTP抑制剂vanadate增强。genistein(1～ 30μmol·L-1)呈浓度依赖性抑制Glu触发的Ca2 + 内流。vana date则浓度依赖性增强Glu触发的Ca2 + 内流。结论　对尼莫地平敏感的VDCC及对SK&F96 36 5敏感的非VDCC没有参与Glu触发的Ca2 + 内流。PTK激活参与了Glu触发的Ca2 + 内流     

蛋白酪氨酸磷酸化参与调控主动脉平滑肌细胞容积调节性氯通道电流

目的　探讨蛋白酪氨酸磷酸化在胚胎鼠主动脉平滑肌细胞系A10细胞容积调节性氯通道电流中的调控作用。方法　膜片钳全细胞记录技术。结果　①在A10细胞 ,低渗溶液激活一外向整流电流 ,该电流在正电位 (≥ 6 0mV)时缓慢失活。其反转电位为 (- 1 5± 3 4 )mV ,接近Cl-平衡电位 (Ecl=0mV)。降低胞外Cl-浓度其反转电位随之变化。高渗溶液可抑制该电流。②DIDS(10 0 μmol·L-1)电压依赖性抑制容积调节性氯通道电流 ,在 +80mV和 - 80mV的抑制率分别为 5 3 7%± 6 2 %和 2 9 8%± 4 9%。③酪氨酸激酶抑制剂genistein (30 μmol·L-1)抑制该电流 ,在 +80mV和 - 80mV对其抑制率分别为6 2 3%± 11 3%和 6 6 9%± 10 5 % ,其抑制作用无电压依赖性。④酪氨酸磷酸酶抑制剂sodiumorthovanadate(Na3 VO4,5 0 0 μmol·L-1)增强该电流 ,其作用无电压依赖性 ,在 +80mV和 - 80mV电流幅度分别增加了 4 4 8%±14 5 %和 4 7 1%± 13 6 %。结论　A10细胞上存在有容积调节性氯通道。蛋白酪氨酸磷酸化参与调节A10细胞容积调节性氯电流的激活     

酪氨酸激酶抑制剂对cyclopiazoni cacid引起的大鼠主动脉血管环收缩效应的影响

目的　探讨酪氨酸激酶在Ca2 +池操纵性Ca2 +内流中的作用。方法　记录大鼠胸主动脉环收缩反应。结果　①不同剂量酪氨酸激酶抑制剂 genistein (1～ 10 0 μmol·L-1)和tyrphostin 2 5 (Tyr 2 5 ,1～ 30 μmol·L-1)均以浓度依赖性抑制cyclopiazonicacid (CPA)引起的平滑肌收缩平台期。Tyr 2 5的最大作用浓度为 10 μmol·L-1,抑制率为 42 %±11%。② 10 μmol·L-1Tyr 2 5和 1μmol·L-1nifedipine(Nif)对CPA引起电压依赖性Ca2 +通道 (VDCC)开放过程的抑制作用存在部分交叉。③ 1μmol·L-1Nif预处理阻断VDCC作用后 ,10 μmol·L-1Tyr 2 5只能部分阻断CPA引起的Ca2 +池操纵性Ca2 +通道 (SOCC)开放过程 ,再加入 6 0 μmol·L-1SK&F96 36 5可完全阻断SOCC的开放过程。结论　CPA引起平滑肌的收缩过程中 ,蛋白质酪氨酸激酶参与了开启VDCC和SOCC的信号转导过程     

Ca~(2+)运动对α_1-肾上腺素受体引起内源性ClC-3氯通道表达的作用

目的　研究Ca2 +运动对α1 肾上腺素受体引起ClC 3氯通道表达的作用。方法　在A10细胞上 ,用RT PCR和Westernblot检测ClC 3mRNA和蛋白质表达情况。结果　苯肾上腺素 ( 10 μmol·L-1)和thapsigargin( 0 1μmol·L-1)可促进ClC 3mRNA和蛋白质的表达 ;SK&F963 65 ( 10 μmol·L-1)和genistein( 10 μmol·L-1)可抑制苯肾上腺素引起的ClC 3的表达 ,nifedipine( 10 μmol·L-1)无此作用。结论　在A10细胞上 ,通过钙池操纵性Ca2 +通道 (SOCC)的Ca2 +内流参与了α1 肾上腺素受体引起的内源性ClC 3氯通道的表达 ,而通过电压依赖性Ca2 +通道 (VDCC)的Ca2 +内流可能与此无关。蛋白酪氨酸激酶参与了ClC 3氯通道的表达     

酪氨酸激酶抑制剂对hTrp3蛋白介导的α_(1B)-AR引起的Ca~(2+)内流的影响

目的　探讨Trp3(transientreceptorpotential 3)蛋白是否参与α1B AR引起的Ca2 + 内流以及酪氨酸激酶对其调控作用。方法　采用脂质体转染 ,将hTrp3cDNA分别转染到HEK2 93细胞和已有α1B受体稳定表达的HEK2 93细胞 ;Westernblot方法检测Trp3蛋白表达情况 ;Fura 2 /AM荧光分光光度法 ,测定胞浆游离Ca2 + 浓度。结果　HEK2 93细胞上可检测到hTrp3的内源性表达 ,转染后其表达增加。α1B HEK2 93细胞转染hTrp3cDNA后 ,α1B AR引起的Ca2 +内流显著增加 (P <0 0 1) ;转染hTrp3cDNA对thapsigargin诱导的Ca2 + 内流无作用。 5～ 30 μmol·L-1genistein对转染细胞α1B AR诱发的Ca2 + 内流有抑制作用 ,最大抑制率达(75 2± 12 6 ) %。结论　Trp3cDNA转染可能主要通过非CRAC(calciumreleaseactivatedcalcium )途径增加α1B AR引起的Ca2 + 内流 ,这一过程很大程度上依赖酪氨酸激酶的调控     

酪氨酸蛋白激酶在不同α_1肾上腺素受体亚型Ca~(2+)调控中的作用

目的　了解酪氨酸蛋白激酶信号途径在不同α1肾上腺素受体亚型Ca2 +调控中的作用。方法　用Fura 2荧光探针双波长测定细胞胞浆游Ca2 +浓度 ([Ca2 +]i)的方法 ,在分别转染了α1A、α1B和α1D肾上腺素受体cDNA的HEK2 93细胞 ,观察酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein和磷脂酶C抑制剂U7312 2 对激动不同α1肾上腺素受体亚型引起的 [Ca2 +]i 变化的影响。结果　预先用U7312 2 (0 1,10 ,5 0 μmol·L-1)与细胞共同孵育 10min ;用Genistein(10 ,10 0 ,2 0 0 μmol·L-1)与细胞共同孵育 1h。在分别转染了α1A、α1B和α1DcDNA的HEK2 93细胞 ,U73 12 2 和Genistein均能浓度依赖性地抑制肾上腺 (10 μmol·L-1)引起的双相 [Ca2 +]i 的升高。在上述细胞 ,U7312 2 (5 0 μmol·L-1)能完全抑制肾上腺素引起的[Ca2 +]i 升高 ;而用最大有效浓度 10 0 μmol·L-1的Genistein只能部分抑制肾上腺素升高 [Ca2 +]i 的作用。结论　在HEK 2 93细胞 ,不同α1肾上腺素受体亚型 (α1A α1B和α1D)激动均能部分通过酪氨酸蛋白激酶信号途径引起Ca2 +释放和Ca2 +内流。α1肾上腺素受体可能通过G蛋白和酪氨酸蛋白激酶两种途径激活磷脂酶C     

Ca~(2+)经钙激活非选择性阳离子通道进入ECV304内皮细胞

目的　研究钙离子进入ECV30 4内皮细胞株的途径和血管紧张素Ⅱ (AⅡ )对钙内流的影响。方法　用膜片钳的细胞贴附式和全细胞方式记录ECV30 4内皮细胞的通道活动。结果　 (1 )在记录单通道电流时电极液含 1 2 0mmol·L- 1 CaCl2 ,细胞浴液不含K+ 、Na+ 时 ,Ca2 + 经非选择性阳离子通道 (CAN)内流的电导为γ0 =(1 2 90± 2 1 1 ) pS(n =4)。1× 1 0 - 7mol·L- 1 AⅡ可显著增强通道电流幅度和延长通道开放时 ,其电导增大为γ1 =(2 2 1 8± 2 2 9)pS(n =4)。全细胞记录得到的结果与单通道的一致。 (2 )用全细胞方式记录到ECV30 4内皮细胞的电压依赖性钙通道电流 ,记录到该峰值电流为 (2 9 32± 3 56)pA(n =4) ,2 0 μmol·L- 1 nifedepine能抑制这个峰值电流 ,被抑制后的电流峰值为 (6 0 0± 3 94)pA(n =4)。 2 μmol·L- 1 BayK8644能显著激活通道活动。结论　Ca2 + 经CAN进入ECV30 4细胞 ,AⅡ可显著增强CAN的钙流     

溶血磷脂酰胆碱刺激脑微血管平滑肌细胞增殖的细胞内信号转导途径

通过测定 [3 H]胸腺嘧啶核苷 ( [3 H]Td R)参入和结晶紫染色法测定平滑肌细胞增殖 ,研究了溶血磷脂酰胆碱 ( LPC)刺激牛脑微血管平滑肌细胞( BCMSMC)增殖的细胞内信号转导途径 .结果显示 ,LPC能浓度依赖性 ( 1 nmol· L-1- 1 0μmol·L-1)诱导 BCMSMC摄取 [3 H]Td R,在 LPC的浓度为 1 0μmol· L-1时作用达最大 ,cpm由 366± 1 42升至 1 761± 2 96( P<0 .0 1 ) ;LPC亦能浓度依赖性( 1 nmol· L-1- 1 0μmol· L-1)诱导 BCMSMC增殖 ,在 LPC浓度为 1 μmol· L-1时促增殖作用达坪值 ,A595nm由 0 .0 60± 0 .0 0 9增至 0 .1 0 0± 0 .0 1 5( P<0 .0 1 ) .丝裂原激活蛋白激酶 ( MAPK)特异性抑制剂 PD980 59( 2 - 50 μmol· L-1) ,血小板衍生生长因子受体抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂 AG 1 2 96( 2 -50 μmol· L-1)以及蛋白质酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素 A( 2 - 1 0μmol· L-1)能浓度依赖性地抑制LPC的上述作用 .表明 LPC能促进 BCMSMC增殖 ,其细胞内信号转导与 MAPK途径有关 .     

雌激素对大鼠心肌细胞钙的调控作用研究

目的　观察雌激素对大鼠心肌细胞钙转运的调控作用。方法　应用膜片钳全细胞记录方法观察L型钙通道电流 (ICa .L) ,共聚焦显微镜系统分析细胞内钙浓度 ([Ca2 + ]i)的变化。结果　应用 10 μmol·L-1和 30 μmol·L-1的 17β Estradiol,分别使ICa .L 抑制到正常的 48 1%± 4 5 %and2 9 3%± 5 2 % (n =5 ,P <0 0 1)。 10 μmol·L-1的 17β Estradiol可升高静息的培养心肌细胞 [Ca2 + ]i,荧光强度 (FI)值由 5 4 2± 13 6增加到 86 5± 15 3(n =6 ,P <0 0 5 ) ;而对具有自发收缩的心肌细胞钙瞬变幅度有明显的抑制作用 ,由给药前的 18 5± 4 3减小到 11 4± 3 9(n =6 ,P <0 0 5 )。17β Estradiol可剂量依赖性地抑制ICa.L。结论　L型钙通道等多种机制参与雌激素对大鼠心肌细胞钙转运的调控作用。     

爱普列特对原代培养大鼠输精管上皮细胞及bcl-2表达的影响

目的　探讨爱普列特对原代培养SD大鼠输精管上皮细胞及原癌基因bcl 2表达的影响。方法　应用HE染色、电镜、流式细胞术和免疫组化方法研究爱普列特对输精管上皮细胞形态改变、细胞凋亡率以及bcl 2表达的影响。结果　 0 1 μmol·L- 1 爱普列特对细胞形态无显著影响 ;0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,细胞呈核固缩、深染、碎裂、染色质边集等多种形态改变 ,电镜下可见典型的凋亡细胞特征 ;流式细胞仪分析结果显示 ,溶剂对照组细胞凋亡率为 3 42 %± 1 49% ,0 1、0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,细胞凋亡率分别为 4 66 %± 2 2 3 % ,39 0 4 %± 1 0 69%和 52 74%± 8 91 % ;免疫组化结果显示输精管上皮细胞bcl 2阳性率为 76 96 %± 9 2 5 % ,0 1、0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,Bcl 2阳性表达的百分率分别为 63 93 %± 3 40 %、52 82 %± 8 66 %和 2 9 64 %± 8 74%。结论　 0 1 μmol·L- 1 爱普列特对大鼠输精管上皮细胞无影响 ,0 3和 1 0 μmol·L- 1 可诱导大鼠输精管上皮细胞发生凋亡 ,其作用机制可能与降低bcl 2表达有关     

Cl~-通道阻断剂对5-HT和CPA引起的兔脑椎基底动脉平滑肌细胞Ca~(2+)内流的影响

目的　在培养的兔脑椎基底动脉平滑肌细胞上观察5 HT和CPA诱导的Ca2 + 内流的特性 ,电压依赖性Ca2 + 通道 (VDC)抑制药尼莫地平 ,非电压依赖性Ca2 + 通道抑制药SK&F963 65及Cl-通道阻断剂DIDS、NPPB对两种激动剂引起 [Ca2 + ]i 反应的影响 ,以探讨脑血管平滑肌细胞中 5 HT引起Ca2 + 内流的特性、Cl-通道与Ca2 + 内流的关系。方法　采用生物荧光双波长影像分析系统瞬即测定单细胞胞质[Ca2 + ]i 技术。结果　① 5 HT和CPA均能诱导平滑肌细胞[Ca2 + ]i 呈双相升高 ,并且 5 HT诱导的Ca2 + 释放是环匹阿尼酸 (CPA)敏感Ca2 + 池的一部分 ;②尼莫地平对 5 HT和CPA触发的Ca2 + 内流无明显影响 ,而SK&F963 65可阻止二者触发的Ca2 + 内流 ;③Cl-通道阻断剂DIDS、NPPB呈浓度依赖性抑制Ca2 + 内流 ,在SK&F963 65最大限度抑制Ca2 + 内流后 ,DIDS、NPPB可进一步抑制Ca2 + 内流 ;而Ca2 +内流被DIDS、NPPB分别最大抑制后 ,SK&F963 65也可进一步抑制Ca2 + 内流。结论　 5 HT引起的Ca2 + 内流是经SK&F963 65敏感的非VDC ,其中包含Ca2 + 释放引起的Ca2 + 内流 (CRAC)成分与非CRAC成分 ,并且这两部分Ca2 +内流均与DIDS、NPPB敏感的Cl-通道开放有关     

Continuous elevation of intracellular Ca2+ is essential for the development of cerebral vasospasm

Subarachnoid hemorrhage (SAH)-induced cerebral vasospasm causes serious neurological morbidity and mortality mainly because of the absence of effective treatment. Therefore, we reviewed the molecular mechanisms involved in the development of the cerebral vasospasm based on the experimental data in the two-hemorrhage canine model. The characteristic feature of vasospasm is a continuous elevation of intracellular Ca2+ levels in the cerebral artery, as indicated by the continuous activation of mu-calpain and Ca2+/calmodulin-dependent myosin light chain kinase (MLCK) phosphorylation of the myosin light chain. In contrast, KCl- or serotonin-induced vasocontraction displays a transient increase in Ca2+ concentration. The elevation of intracellular Ca2+ levels in vasospasm is induced through enhanced Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum and influx from the extracellular space by the activation of tyrosine kinase pathway and also probably by the proteolysis of Ca2+ channel by mu-calpain. Topical application of L-type Ca2+ channel blockers, ethylene-glycol-bis(beta-aminoethylether)N,N'-tetraacetic acid, genistein, calpeptin (a selective inhibitor of calpain), or ML-9 (a selective inhibitor of MLCK) induces the reversal of vasospasm probably as a result of a decrease in intracellular Ca2+ levels mainly due to a reduction of Ca2+ influx by these three inhibitors. Rho-kinase is also activated during vasospasm. It inhibits myosin phosphatase through phosphorylation at the myosin phosphatase target subunit 1 and also probably through phosphorylation of the 17-kDa smooth muscle-specific myosin phosphatase inhibitor (CPI-17) to bring about Ca2+-independent vasospasm. This interpretation is supported by the reversal of vasospasm with Y-27632, a specific inhibitor of Rho-kinase. Arachidonic acid produced during vasospasm might inhibit myosin phosphatase probably directly and via activation of Rho-kinase or atypical protein kinase C (PKC). PKC activated during vasospasm may inhibit myosin phosphates directly and by phosphorylating CPI-17. The protein levels of thin filament-associated proteins, calponin and caldesmon, are decreased in vasospasm, whereas their phosphorylation levels are increased. Both changes probably contribute to the enhancement of vascular smooth muscle contractility. Furthermore, contractile and cytoskeletal proteins appear to be degraded in vasospasm probably by proteolysis with mu-calpain, suggesting that degradation of the structural and functional mechanisms related to smooth muscle contraction occurs. Thus, the mechanisms responsible for the development of cerebral vasospasm are complicated, but the prevention of intracellular Ca2+ elevation induced by SAH may not activate MLCK, calpain and PKC to largely suppressing the development of vasospasm.     

Cl~-通道在内皮素-1引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的　研究Cl-通道在内皮素 1(endothelin 1,ET 1)引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用 ,并探讨其可能的作用机制。方法　通过细胞计数和3H TdR参入实验 ,并结合fura 2 /AM荧光测定胞浆游离Ca2 + 浓度 ([Ca2 + ]i)等技术 ,观察了Cl-通道阻断剂对ET 1引起的 [Ca2 + ]i 变化及血管平滑肌细胞增殖的影响。结果　Cl-通道阻断剂DIDS可呈浓度依赖性地抑制 10nmol·L-1ET 1引起的血管平滑肌细胞增殖 ,其它Cl-通道阻断剂如IAA 94、NPPB、SITS、DPC和速尿均无此作用 ,DIDS也能抑制 10nmol·L-1ET 1引起的内流相 [Ca2 + ]i 升高 ,而对ET 1引起的Ca2 + 释放无影响 ;预先将细胞与 1μmol·L-1nifedipine作用后 ,3μmol·L-1DIDS对 10nmol·L-1ET 1引起的内流相 [Ca2 + ]i 升高及血管平滑肌细胞增殖不再有效 ,将细胞与 10 μmol·L-1SK&F96 36 5预孵后 ,DIDS却能进一步抑制ET 1的上述作用 ;3μmol·L-1DIDS对 30mmol·L-1KCl引起的胞浆[Ca2 + ]i升高无影响。结论　DIDS可通过阻断Cl-通道来抑制ET 1因促发Cl-通道开放经电压依赖性钙通道的Ca2 +内流及细胞增殖 ,DIDS敏感的Cl-通道可能在ET 1促发的Ca2 + 内流及血管平滑肌细胞增殖的调控上都起着重要的作用     

ClC-3氯通道对Thapsigargin触发的Ca~(2+)运动的影响

目的探讨ClC-3氯通道与Thapsigargin(TG)触发的Ca2+运动的关系。方法在PC12细胞中转染全长ClC-3cDNA,利用生物荧光影像分析系统测定胞质Ca2+技术探讨ClC-3氯通道对TG触发的Ca2+运动的影响。结果与对照组相比,ClC-3蛋白过表达对TG触发的PC12细胞静息[Ca2+]i的Ratio值和Ca2+释放的Ratio值无影响(P>0.05)。但使Ca2+内流量明显降低(P<0.05)。SK&F96365可以浓度依赖的抑制TG触发的Ca2+内流,但与对照细胞及空载体转染细胞相比,SK&F96365对ClC-3蛋白过表达细胞Ca2+内流的抑制作用明显减弱(P<0.05)。结论ClC-3蛋白参与TG触发的经Ca2+池操纵的Ca2+内流(store-operated Ca2+entry,SOCE)调节。     

HEK293细胞—— 一种研究受体Ca~(2+)调控功能的理想模型

目的了解ＨＥＫ２９３细胞Ｃａ２＋代谢的生物学特性。方法用Ｆｕｒａ－２荧光探针双波长测定细胞胞浆游离Ｃａ２＋浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）方法，观察多种能改变细胞内Ｃａ２＋代谢的药物对天然的和转染了α１Ｂ肾上腺素受体ｃＤＮＡ的ＨＥＫ２９３细胞［Ｃａ２＋］ｉ的影响。结果在含１．５ｍｍｏｌＬ－１ＣａＣｌ２的缓冲液中，ＫＣｌ５０ｍｍｏｌＬ－１和ＢａｙＫ８６４４１０μｍｏｌＬ－１不影响ＨＥＫ２９３细胞的［Ｃａ２＋］ｉ；ｃｙｃｌｏｐｉａｚｏｎｉｃａｃｉｄ（ＣＰＡ０．０１，０．１，１０μｍｏｌＬ－１）能浓度依赖性地引起ＨＥＫ２９３细胞的［Ｃａ２＋］ｉ呈双相升高，其中的Ｃａ２＋内流相不受ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ（１０μｍｏｌＬ－１）的影响；但可被１ｍｍｏｌＬ－１ＮｉＳＯ４完全抑制。在无Ｃａ２＋的缓冲液中，咖啡因２０ｍｍｏｌＬ－１和ｒｙａｎｏｄｉｎｅ１μｍｏｌＬ－１均不影响ＨＥＫ２９３细胞的［Ｃａ２＋］ｉ。先用ＣＰＡ（３０μｍｏｌＬ－１）耗竭ＨＥＫα１Ｂ细胞内Ｃａ２＋贮存池后，肾上腺素１０μｍｏｌＬ－１能进一步升高［Ｃａ２＋］ｉ。在有Ｃａ２＋或无Ｃａ２＋的缓冲液中，肾上腺素均可引起ＨＥＫα１Ｂ细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高。结论ＨＥＫ２９３细胞?