FK228阻断细胞生存信号通路诱导前列腺癌细胞凋亡

目的：研究组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂FK228诱导前列腺癌细胞系DU145凋亡的作用机制。方法：MTT比色法测定FK228抑制DUl45细胞增殖及其对细胞的杀伤效应；瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态的变化；流式细胞术分析细胞周期的改变；蛋白印迹实验检测细胞内蛋白表达水平的变化。结果：FK228明显抑制DU145细胞体外增殖，并介导细胞死亡；12．5ng／ml FK228作用细胞48h后，细胞存活率降至63．7％；伴有细胞形态改变及细胞周期阻滞于G0／G1期；细胞内多种重要的激酶蛋白，包括EGFR、Her2、Raf-1、Src、Cdk4、Akt及凋亡抑制蛋白Survivin均发生了不同程度的降解，细胞内两条重要的生存信号通路Raf-MEK—ERK及P13K／Akt被阻断，细胞发生凋亡。结论：FK228可以通过清除细胞内重要信号蛋白、阻断细胞生存信号通路来诱导DU145细胞发生凋亡。     

卡马西平对雌激素依赖性乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制的研究

背景与目的：卡马西平是一种应用多年的抗癫痫药,最近研究证明其具有组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor,HDI）的性质。而已知的HDI多具有抗肿瘤作用。本实验旨在探讨卡马西平对雌激素受体α（estrogenreceptorα,ERα）阳性乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法：利用磺酰罗丹明B色度法（sulforhodamine B,SRB）分析不同情况下卡马西平对细胞增殖的影响。Western blot法检测ERa、Cyclin D1等相关蛋白的表达水平：RT—PCR法检测相应mRNA水平的变化：免疫荧光法测定他莫昔芬耐药细胞MCF-7RT中HER-2的表达;免疫沉淀技术检测Hsp90的分子伴侣功能及乙酰化水平。结果：卡马西平处理ERα阳性细胞MCF-7及T47D时,显著抑制雌二醇刺激的细胞增殖效应（P〈0．01）;卡马西平与4羟基他莫昔芬（4-OHT）联合处理MCF-7细胞,对雌二醇引起的细胞增殖抑制呈相加作用（q=1．00）;在MCF-7RT细胞中,卡马西平逆转了4-OHT的刺激增殖作用（P〈0．01）;卡马西平处理可以降低ERα阳性细胞中ERα、Cyclin D1在蛋白及mRNA水平的表达,并降低MCF-7RT细胞中HER-2表达;ERα、Cyclin D1的表达降低可以被26s蛋白酶体抑制剂MG132抑制;卡马西平可以促进Hsp90乙酰化并破坏其分子伴侣功能。结论：卡马西平明显抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖,该作用可能部分通过促进ERα、Cyclin D1的蛋白酶体降解途径实现。卡马西平可以通过降低HER-2表达逆转与HER-2相关的4-OHT耐药。     

维甲酸联合他莫昔芬对人乳腺癌细胞株作用的研究

目的:探讨他莫昔芬(TAM)与维甲酸(ATRA)联合对人乳腺癌他莫昔芬耐药株的作用.方法:在体外培养条件下,分别或联合应用ATRA和TAM作用于MCF-7人乳腺癌他莫昔芬耐药株(MCF-7/T)及敏感组(MCF-7/S).MTT比色法分析细胞生长抑制作用;用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期分布、凋亡率及用药前后Bcl-2、Bax、Fas和FasL蛋白的变化.结果:TAM能抑制ER阳性MCF-7/S的生长,阻滞细胞周期于G0/G1期,并可诱导细胞凋亡,TAM不能抑制MCF-7/T的生长; ATRA预处理细胞24 h后,TAM抗乳腺癌细胞MCF-7/S的作用增强,且恢复了MCF-7/T对TAM的敏感性.ATRA与TAM联用后,MCF-7/T细胞Bcl-2蛋白表达下调,细胞Bax、Fas和FasL蛋白表达水平未见明显变化.结论:体外条件下,TAM通过影响细胞周期、诱导细胞凋亡而发挥抗ER阳性MCF-7/S作用;视黄酸能加强TAM对激素敏感细胞MCF-7/S的抗乳腺癌作用,恢复耐受细胞MCF-7/T对TAM的敏感性.同时恢复TAM对MCF-7/T的促凋亡作用.     

热休克蛋白90抑制剂对LoVo细胞生长及细胞周期的影响

背景与目的:热休克蛋白90(heat shock protein90,Hsp90)是体内重要的伴侣分子,体内许多重要的蛋白质是其底物蛋白质,但其本身不能降解底物蛋白,只能与底物相互作用,起到分子伴侣的作用.Hsp90抑制剂能抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,导致周期阻滞,破坏tfsp90与底物的结合及促进Hsp90底物蛋白质降解.为探讨Hsp90与生存素(Survivin)同时作为治疗靶点的效应及可能机制,本实验观察Hsp90抑制剂17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔得霉素(17-AAG)对人结肠癌LoVo细胞增殖、细胞周期以及对周期相关蛋白Survivin水平的影响.方法:用四氮唑盐还原法(MTT法)检测17-AAG对LoVo细胞增殖影响;Propidium Iodide(PI)染色检测细胞周期变化;Western blot检测Hsp90底物蛋白Survivin的变化.结果:17-AAG呈时间-剂量-依赖性抑制LoVo细胞增殖.100、500、和800 ng/ml 17-AAG作用于LoVo细胞24 h后,细胞增殖抑制率分别为21.00%、40.81%、60.34%,作用48 h后,细胞增殖抑制率分别为27.29%、48.17%、80.97%,作用72 h,细胞增殖抑制率分别为34.45%、67.81%和88.42%.17-AAG导致LoVo细胞周期改变,100和500 ng/ml 17-AAG作用72 h,G0/G1期分别占(61±3)%及(74±3)%,LoVo细胞阻滞于G0/G1期,未加药处理的LoVo细胞G0/G1期比例仅为(48.2±0.8)%(P＜0.001).500 ng/ml 17-AAG作用于LoVo细胞72 h可部分清除Hsp90底物蛋白Survivin(P ＜0.001).结论:17-AAG呈时间-剂量依赖性抑制LoVo细胞增殖,阻滞LoVo细胞于G0/G1期,并能部分清除Survivin.     

雌激素受体β在乳腺癌他莫昔芬内分泌治疗耐药中的作用

目的：探讨雌激素受体β（estrogen receptor β,ERβ）的表达与乳腺癌他莫昔芬（tamoxifen,TAM）内分泌治疗耐药的相关性及其机制。方法：以前期构建的ERα/ERβ不同表达的人乳腺癌MCF-7细胞株\[M/HK（阴性对照）、M/siα（ERαlow/ERβhigh）、M/siβ（ERαhigh/ERβlow）细胞\]为研究对象,MTT法评估乳腺癌细胞对TAM的耐药性;用半定量RT-PCR法检测细胞中耐药相关基因MDR1、TOPOⅡ、LRP和GST-π的mRNA表达水平,用Western blotting法检测细胞中耐药相关信号通路MAPK、PI3K/Akt的p-ERK、p-Akt蛋白表达水平。结果：与对照组MCF-7细胞相比,MCF-7细胞中的ERβ高表达可促进高浓度TAM（1、5、10 μmol/L）对MCF-7细胞增殖的抑制作用\[（45.788 ± 1.641）% vs （24.288±1.170）%,（57.899±1.583）% vs（31.499±1.978）%,（59.853 ±1.648）% vs（38.039±1.482）%;均P<0.05 ）\],该抑制作用与TAM浓度呈剂量依赖性。ERβ高表达可显著抑制MCF-7细胞耐药基因MDR1、TOPOⅡ、LRP的 mRNA表达水平（0.431±0.032 vs 0.932±0.083,0.234±0.008 vs 0.391±0.002,0.47±0.028 vs 0.586±0.036;均P<0.05);可显著下调Akt和ERK蛋白的磷酸化水平（0224±0.006 vs 0.437±0.007,0.367±0.015 vs 0.756±0.039;均P<0.05)。结论： ERβ表达水平可影响乳腺癌细胞MCF-7对TAM的耐药性,该作用机制可能与耐药基因的表达及PI3K/ AKT、MAPK信号通路激活有关。     

雌激素受体β及其剪切变异体与乳腺癌他莫昔芬耐药的关系

目的探讨雌激素受体（ER）亚型（ERβ）及其剪切变异体（ERβcx）的表达与乳腺癌他莫昔芬耐药的关系。方法 （1）对乳腺癌他莫西芬敏感MCF-7细胞和他莫西芬耐药MCF-7细胞进行培养,利用去甲基化物5-氮杂胞苷（5-Aza-2-deoxycytidine,5-AZA-CdR）去甲基化的作用,对MCF-7细胞进行药物处理获得MCF-75-AZA-CdR细胞,采用Western blot方法检测3组细胞中ERβ和ERβcx蛋白的表达。（2）取对数生长期生长良好的乳腺癌MCF-7细胞株,按2.5×103细胞/孔接种于96孔细胞培养板板中,实验组分为他莫细芬处理的MCF-7细胞（MCF-7＋TAM组）和MCF-75-AZA-CdR细胞（MCF-75-AZA-CdR细胞＋TAM组）,对照组为MCF-7细胞,采用MTT比色法,观察3组细胞的增殖情况。统计学分析采用单因素方差分析和重复测量方差分析。结果 （1）ERβ蛋白在他莫西芬敏感MCF-7细胞中的表达高于他莫西芬耐药的MCF-7细胞,两组细胞间差异有显著的统计学意义（P=0.000）;ERβcx蛋白表达在两组之间差异无统计学意义（P=0.366）。MCF-75-AZA-CdR细胞ERβ和ERβcx蛋白表达均高于他莫西芬敏感MCF-7细胞和他莫西芬敏耐药MCF-7细胞（P均=0.000）。（2）与对照组MCF-7细胞相比,他莫西芬明显降低了MCF-7＋TAM组和MCF-75-AZA-CdR细胞＋TAM组的细胞增值速度并抑制细胞生长;且他莫西芬抑制细胞增殖作用MCF-75-AZA-CdR细胞＋TAM组强于MCF-7＋TAM组（P=0.000）。结论 ERβ蛋白在他莫西芬敏感MCF-7细胞中的表达高。MCF-75-AZA-CdR细胞中ERβ和ERβcx蛋白的表达均高。他莫西芬抑制细胞增殖作用在他莫西芬处理的MCF-75-AZA-CdR细胞中强     

热休克蛋白90α在乳腺癌中的表达及与预后的关系

目的探讨热休克蛋白90α(Heat shock protein 90α,Hsp90α)在乳腺癌中的表达,评估其在乳腺癌预后中所起的作用.方法用免疫组织化学方法检测62例手术切除的乳腺癌组织中Hsp90α的表达,探讨其与临床病理特征的关系及对预后的影响.结果 (1)Hsp90α在乳腺癌组织中的阳性表达率为38.9%(14/36).(2)Hsp90α表达与月经状况、肿瘤大小、淋巴结转移数以及组织学分级之间均不具相关性.(3)Hsp90α阴性表达组无病生存期及总生存期均明显优于Hsp90α阳性表达组(P=0.0079及P=0.0008).(4)Cox回归单因素分析显示淋巴结转移数目、组织学分级、肿瘤大小、Hsp90α表达及TNM分期与无病生存期及总生存期均明显相关;在Cox回归多因素分析中,发现腋淋巴结转移个数、组织学分级、Hsp90α表达、肿瘤大小与无病生存期及总生存期明显相关,而TNM分期末进入Cox回归模型.Hsp90α表达有减少生存时间的危险.结论 Hsp90α在乳腺癌中有一定的表达,Hsp90α有可能成为判断乳腺癌预后的有用指标.     

腺苷酸活化蛋白激酶增强乳腺癌对多柔比星化疗敏感性的机制

背景与目的：腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在调控细胞代谢和能量平衡方面起着重要作用,并与细胞增殖、生存和多种信号通路密切相关。近年来发现AMPK参与肿瘤的抑制和耐药。该研究旨在探讨AMPK对多柔比星抑制乳腺癌作用的影响及其机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(meth-ylthiazolyl tetrazolium,MTT)法检测多柔比星作用后对MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα细胞增殖的影响;Hoechst染色法观察各组细胞凋亡形态;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测各组细胞凋亡率;荧光酶标仪检测3组细胞多柔比星累积量;蛋白[质]印迹法(Western blot)检测各组细胞中耐药蛋白及凋亡相关蛋白的表达。结果：多柔比星对MCF-7/adr细胞增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性,其作用24、48 h的IC50值分别为(36.8±2.1)和(28.8±1.3)μg/mL。过表达AMPKα可增加多柔比星对MCF-7/adr细胞的生长抑制作用,呈剂量和时间依赖性,其作用24、48 h的IC50值分别为(16.0±0.7)和(4.2±0.2)μg/mL。荧光形态分析发现多柔比星联合AMPKα能诱导MCF-7/adr细胞凋亡。1.0μg/mL多柔比星作用48 h后,MCF-7/adr、MCF-7/adr-vector及MCF-7/adr-AMPKα细胞的凋亡率分别为(12.0±1.4)%、(12.7±1.6)%和(32.0±4.2)%,MCF-7/adr细胞中AMPKα过表达明显提高MCF-7/adr细胞对多柔比星的敏感性。荧光酶标仪检测显示,过表达AMPKα能明显提高细胞内多柔比星的累积量,具有浓度依赖性。Western blot实验结果显示,与MCF-7/adr和MCF-7/adr-vector细胞比较,MCF-7/adr-AMPKα细胞中Bax、细胞色素c(Cyto c)的释放、caspase-3和多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶降解产物(cleaved PARP)蛋白表达明显增加,而细胞外排泵P-糖蛋白(P-gp)和Bcl-2蛋白表达降低。结论：AMPKα可通过抑制耐药细胞外排泵以及调控凋亡相关蛋白的表达,从而增强乳腺癌耐药细胞对多柔比星的化疗敏感性。     

雌孕激素对乳腺癌MCF-7细胞热休克蛋白mRNA水平的影响

目的：研究一定浓度雌、孕激素作用于MCF-7细胞一定时间后,细胞中VEGF、Hsp70、Hsp90和NF-κBp50 mRNA水平上的变化,进而揭示雌、孕激素对乳腺癌MCF-7细胞株作用的分子生物学机制.方法：体外培养人乳腺癌MCF-7细胞株,分4组给予不同处理因素,分别为对照组、雌激素组、孕激素组和雌孕激素混合组.给药72 h后MTT法测细胞570 nm分光光度值.RT-PCR法观察各组Hsp70、Hsp90、VEGF和NF-κBp50 mRNA表达水平.结果：与对照组相比,10^-9mol/L雌激素促进细胞生长作用最明显,10-7mol/L孕激素本身对MCF^-7细胞生长无明显影响,但在雌、孕激素混合组孕激素部分抑制雌激素促细胞增殖作用,具有统计学意义.与对照组相比,雌激素上调细胞中Hsp70、Hsp90、VEGF和NF-κBp50 mRNA水平;孕激素组Hsp70、Hsp90、VEGF和NF-κBp50 mRNA水平与对照组差异无统计学意义.孕激素可以部分抑制雌激素对MCF-7细胞Hsp70、Hsp90、VEGF和NF-κBp50 mRNA的上调作用.结论：雌激素促进乳腺癌细胞生长,可能是雌激素与癌细胞受体结合后通过某种途径刺激Hsp70、Hsp90、NF-κBp50及VEGF的表达,进而抑制癌细胞的凋亡,促进细胞增殖.孕激素通过抑制雌激素对Hsp70、Hsp90、NF-κBp50和 VEGF mRNA的上调作用,进而抑制其促进细胞增殖作用.雌、孕激素促进或抑制细胞增殖,与其对Hsp70、Hsp90、NF-κBp50及VEGF基因的调控是密切相关的.