猕猴不同组织器官中黄嘌呤脱氢酶 /氧化酶基因的mＲNA 表达的半定量 ＲT - PCＲ 检测方法的建立

摘要: 目的 建立半定量 ＲT-PCＲ 检测方法检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶( XDH /XO) 的 mＲNA 的表达。方法 分别提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总 ＲNA,用 ＲT-PCＲ 二步法进行 XDH /XO 基因片段扩增,内参基因选用管家基因 GAPDH,对获得的目的片段进行序列测定以鉴定其特异性,在凝胶影像分析仪 Quantity one 软件得出其电泳条带的灰度值( IOD) ,计算目的基因与内参基因比值得到猕猴不同组织 XDH/XO 的 mＲNA 的相对表达量。结果 建立了半定量 ＲT-PCＲ 检测方法,猕猴不同组织 XDH /XO 的 mＲNA 表达在肝脏组织中表达水平最高,其次为心肌,肾脏,睾丸,皮肤。结论 本研究所建立的半定量 ＲT-PCＲ 检测方法可应用于检测猕猴各组织器官组中的 XDH /XO 的mＲNA 的表达差异。     

实时荧光定量RT-PCR检测糖皮质激素α-受体mRNA表达水平方法的建立

建立用荧光定量RT-PCR的方法检测人糖皮质激素α-受体(GR-α)mRNA水平的标准曲线.根据人糖皮质激素α-受体mRNA序列(GeneBank No. NM_000176)设计引物,反转录出cDNA,再插入到PMD18-T载体中.再根据cDNA设计引物和探针,采用TaqMan探针荧光定量RT-PcR的检测方法,构建人GR-α基因表达量的标准曲线.由PMD18-T-GR-α所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×101-1×105拷贝数的人GR-α基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈较好的线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠.     

RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因 转录水平方法的建立

目的 建立实时荧光定量(RT-qPCR)检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的方法,以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。方法 提取Wistar大鼠肝脏组织中总RNA,经逆转录得到cDNA, 以10倍为稀释因子稀释为5个浓度梯度,使用设计的引物序列和内参基因进行RT-qPCR检测,得到XDH/XO基因表达的标准曲线。进而检测Wistar大鼠高尿酸血症动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结果 RT-qPCR法检测得到的XDH/XO基因标准曲线溶解峰单一,R2接近1,能检测出高尿酸动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结论 RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法具有定量准确,重复性好的特点,可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面。     

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV) 3D基因保守区段设计并合成1对引物, 以提取的EMCV核酸为模板, 分别进行荧光定量RT PCR扩增, 优化反应体系及条件, 建立脑心肌炎病毒荧光定量RT PCR检测方法, 并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证. 结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%, 最低检测限为102 copies/ μL; 纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.     

鼠脑心肌炎病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立快速诊断鼠脑心肌炎病毒感染的荧光定量RT-PCR方法。方法根据鼠脑心肌炎病毒(EMV)PEC9毒株全基因组序列(Gen Bank登录号:DQ288856.1),设计一对特异性引物和TaqMan探针,建立EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果建立的荧光定量PCR方法,标准曲线的线性关系良好,r2值可达0.99,敏感性最低检测限为1个拷贝数,高于普通PCR方法 1000倍,其特异性强,与其他常见感染的小鼠病毒株均无特异性扩增,批内和批间变异系数均小于2%。利用该方法对上海市120份小鼠心肌样品进行检测,未检测到阳性感染。结论本研究为鼠脑心肌炎病毒感染的分子检测,为制定国家标准提供良好的方法。     

成熟猕猴桃果实不同组织中ACC氧化酶基因的表达差异研究

了猕猴桃“海沃特”成熟果实各组织中ACC氧化酶基因的转录水平和翻译水平对乙烯生成的影响，结果表明：（1）乙烯生成具有组织差异性；（2）ACC氧化酶基因mRNA的表达在各组中水平相似；（3）ACC氧化酶的表达水平具有显著的组织差异性及时间顺序性，因此，ACC氧化酶的瑶达水平的高低可能是导致乙烯生成的组织差异性的主要原因之一。     

一种检测环氧合酶的新方法——半定量RT-PCR法

作者研究的目的是建立一种较为灵敏、简便的方法检测环氧合酶COX 2 .先设计了一对针对COX 2的特异性引物 ,建立了以半定量逆转录 聚合酶链反应 (Semi QuantitativeReverseTranscrip tionPCR ,SQRT PCR)方法检测COX 2的mRNA ,用该方法检测 7种结肠癌细胞和非甾体类抗炎药吲哚美辛 ,作用于其中一种细胞后的COX 2mRNA .实验结果显示 ,半定量RT PCR法可以灵敏、快速地反映COX 2mRNA表达水平的变化 ,为寻找新的COX 2选择性抑制剂和分析NSAIDs抗炎作用机理提供了一种新的方法 .     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Barrett发表的犬瘟热病毒 (CDV)Onderstepoort弱毒株融合蛋白 (F)基因序列 ,设计合成了一对寡聚核苷酸引物 ,并以南京农业大学惠赠的Onderstepoort标准株反转录产物为模板 ,建立了CDV的RT PCR方法 ,并应用于CDV的诊断。结果表明 ,以该对引物 ,只能从CDV ONP标准株反转录产物中扩增出大小为 32 4bp的核苷酸片段 ,与理论设计值大小一致 ,而正常Vero细胞和同为副粘病毒科的新城疫病毒 (NDV)作为对照 ,病毒扩增结果为阴性。RT PCR可检出 1μl作 10 6倍稀释的CDV ONP标准株反转录产物 ,说明其具有很高的敏感性。应用试验结果 ,可从感染CDV犬的组织病料中提取RNA ,反转录产物中也扩增出 32 4bp的核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感性、特异性好的CDV的RT PCR检测方法 ,也为F基因的克隆和序列测定及表达奠定了基础。     

快速检测猪瘟免化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法．结果表明：该方法检测的最低拷贝数为45拷贝／μL,灵敏度比普通PCR方法高10^4倍,在较广的范围内（4．5×10^1-4．5×10^6拷贝／μL）有良好的线性关系（r=0．994）;分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻,黏膜病病毒作为模板进行TaqMan RT-PCR扩增,未出现阳性信号：4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1．90％～5．82％,组间试验变异系数为4．02％～5．69％：HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3．72％～4．93％;组间试验变异系数为2．99％～4．02％．该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具．     

常规RT-PCR快速检测诺如病毒方法的建立

目的建立一种可同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒(Norovirus,NOV)的常规RT-PCR方法.方法针对GⅠ、GⅡ型诺如病毒RdRp区域的基因进行引物设计,优化PCR反应体系及条件,评价该方法的灵敏度、特异度.结果该引物对诺如病毒的特异度强,同一体系内的GⅠ、GⅡ型诺如病毒相互之间无干扰,与轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒同时检测无交叉反应;对GⅠ、GⅡ型诺如病毒核酸的最低检测限值是10~3拷贝/μL.结论本研究建立常规RT-PCR检测方法对GⅠ、GⅡ型诺如病毒进行快速检测,具有很好的灵敏度和特异性.     

巴马香猪CYP3A29mRNA组织分布的TaqManRT—PCR分析

为探讨巴马香猪CYP3A29 mRNA的组织分布特征,全面比较其与人CYP3A4 mRNA组织分布规律,利用TaqMan RT-PCR技术对巴马香猪主要组织CYP3A29 mRNA进行定量.结果表明,巴马香猪CYP3A29 mRNA的组织分布特征与报道的人CYP3A4相似,且均以肝脏最高,从转录水平提示巴马香猪及其肝脏均可以用作人CYP3A4的药物代谢研究模型.     

绵羊附红细胞体感染PCR检测方法的建立

为建立特异、敏感、快速的绵羊附红细胞体感染诊断方法,本试验根据已测得的绵羊附红细胞体16S rRNA基因序列（GeneBank：EU916726、FJ440328）,设计1对特异性引物,建立了绵羊附红细胞体的PCR诊断方法。特异性实验和敏感性实验结果表明,该方法与绵羊肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌、枯草杆菌均无交叉反应,能检测到绵羊附红细胞体最低DNA量为5．2pg/μL．在-80℃存放1年的皿样中也检测到阳性样品。通过临床血样检测,证明该方法可以用于本病的早期感染和隐性感染的检测。     

小鼠巨细胞病毒PCR 诊断方法的建立及其应用

摘要: 目的建立小鼠巨细胞病毒( MCMV) PCR 检测方法,并进行初步应用。方法根据NCBI 公布的巨细胞病毒设计引物,进行PCR 体系优化、敏感性、特异性测试; 运用优化后的方法,对87 份小鼠血清进行检测,对阳性样本进行测序分析。结果建立的小鼠巨细胞病毒PCR 方法灵敏度高,特异性好,初步检测4 个屏障设施的87 份小鼠血清, 13 份为阳性,通过测序证实为小鼠巨细胞病毒,验证了此方法的可行性。结论为小鼠巨细胞病毒的快速检测提供了方法。     

SARS病毒的S1蛋白基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

为了建立方便、敏感和特异的SARS病毒血清学诊断方法,利用PCR扩增,克隆了SARS冠状病毒S蛋白基因中从第68～918位碱基的基因序列(S1蛋白).并通过pGEX-4T1表达系统在大肠杆菌BL21中高效表达了SARS病毒S1蛋白,用超声波破碎菌体及用不同浓度的尿素洗涤包涵体,纯化了S1蛋白,纯度可达75%以上.以在E.coli高效表达的S1蛋白为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG为二抗,建立了检测SARS抗体的间接ELISA方法.经检测,筛选出最佳反应条件为5μg/孔.用纯化的E.coli表达的抗原包被酶标板,用5 g/L的小牛血清进行封闭,以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清.实验表明,应用表达的蛋白作为诊断SARS抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点.     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(RV)的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明:建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。     

药用丁基胶塞溶出物2,6-二叔丁基苯酚检测方法的建立

根据静注人免疫球蛋白(intravenous human immunoglobulin,pH4)和人血白蛋白的性质,选择高氯酸作为沉淀剂,磷酸三丁酯作为内标,建立血液制品中2,6-二叔丁基苯酚的检测方法,同时利用专属性、准确性、重复性、线性、定量限、范围、中间精密度7个内容确认该方法是否有效.结果表明建立的方法在测定2,6-二叔丁基苯酚过程中无蛋白质干扰,且2,6-二叔丁基苯酚和内标磷酸三丁酯具备较好的分离度,各验证结果均符合预期要求,仪器定量限为0.3μg/mL.     

仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

一种马铃薯病毒RT-PCR诊断新方法

对传统的植物病毒RNA苯酚提取法进行改进;同时设计并优化单管RT-PCR(O ne-tube RT-PCR)方法,使传统的RT-PCR两步反应在一个反应体系中同时进行,依据马铃薯Y病毒和马铃薯S病毒的基因组RNA保守序列设计2套特异性引物,采用上述新建立的检测方法对染病的马铃薯叶片组织进行病毒检测,结果与G eneB ank中报道的这两种马铃薯病毒核苷酸序列进行B last比较,同源性达到96%以上,用这种新型诊断方法对马铃薯病毒核酸进行了浓度检测,实验结果证明,这种新型马铃薯病毒诊断方法具有可靠、快速、简便等特点.