体外表达的Glypican-3的CTL表位肽诱导特异性免疫应答

目的 探讨体外表达的Glypican-3(GPC3)能否诱导出GPC3特异性的细胞免疫应答.方法 体外表达GPC3的CTL表位肽GPC3298-306及GPC3144-152偶联血蓝蛋白(KLH)后免疫Balb/c小鼠,检测免疫后小鼠脾淋巴细胞免疫活性,包括IFN-γ的分泌,以及该淋巴细胞对表达GPC3的鼠肿瘤细胞细胞毒活性.结果 经GPC3298-306及GPC3144-152免疫后,小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的T淋巴细胞阳性率明显增高(P＜0.01);脾淋巴细胞中CD4+T/CD8+T比值亦明显升高(P＜0.05);脾淋巴细胞对表达GPC3的鼠肿瘤细胞有特异性的杀伤作用.结论 体外表达的GW3的CTL表位肽能诱导出GPC3特异性的细胞免疫,提示体外表达的GPC3的CTL表位肽GPC3298-306及GPC3144-152可能在在以GPC3为靶向的抗肿瘤免疫治疗中发挥重要作用.     

尿酸对HBV表位肽S28-39负载DC诱导免疫效应的影响

目的 观察尿酸对由HBV表面抗原表位肽负载的树突状细胞诱导免疫效应的影响.方法 以负载肽S28-39的小鼠骨髓来源树突细胞,联合尿酸(uric acid, UA)尾静脉注射接种小鼠,每周1次,共2次.分为DC对照组,联合尿酸组,尿酸对照组,正常对照组.流式细胞仪法检测特异性CTL活性;ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ水平.结果 体内S28-39特异性CTL,以联合尿酸接种组杀伤活性最强;联合尿酸接种组脾细胞IFN-γ分泌较对照组增高.结论 尿酸能够增强乙肝表位肽负载的树突细胞诱导的S28-39特异性CTL杀伤活性;能促进免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ.尿酸具有增强负载S28-39树突细胞诱导的细胞免疫效应的活性.     

SARS冠状病毒S蛋白表位合成肽抗原性的研究

目的　研究SARS病毒合成肽疫苗。方法　根据目前已知SARS病毒的基因组序列及其编码的蛋白质 ,选择了SARS病毒编码的spike蛋白抗原表位蛋白质序列 ,运用计算机抗原表位预测技术 ,筛选抗原表位 ,以合成肽抗原表位。通过对SARS病人血清进行筛选确定与血清高交叉反应的 3个短肽 ,再合成多重抗原肽 (multipleantigenicpeptide ,MAP) ,与KLH偶联后免疫小鼠。结果　筛选的 3条与SARS病人血清反应强的肽 ,免疫小鼠均产生了高效价的抗体。结论　以合成肽为免疫原研究SARS病毒肽疫苗有着广阔前景。     

卵泡刺激素受体(FSHR32-44)肽疫苗对雄性小鼠生殖器官影响

目的探讨FSHR32-44肽疫苗对雄性小鼠的生殖器官及机能影响。方法 Balb/c雄性小鼠随机分FSHR32-44(20μg)组、FSHR32-44(80μg)组、FSHR140蛋白组及PBS组(对照组),用竞争性RIA法检测血睾酮水平、HE染色观察睾丸及附睾组织病理改变、硝酸镧示踪法观察血睾屏障的超微结构变化。结果 FSHR32-44(20μg)组、FSHR32-44(80μg)组、FSHR140蛋白组及PBS组(对照组)的血睾酮水平分别为(2.65±0.34)%、(2.63±0.25)%、(2.4±0.56)%及(2.7±0.28)%,肽组与对照组比较,睾酮水平变化无统计学差异(P>0.05);蛋白组与对照组比较,睾酮水平下降(P<0.05)。光镜下肽组及蛋白组中的睾丸及附睾精子数减少,但蛋白组中睾丸的精原细胞出现水肿及点状坏死;电镜下肽组的血睾屏障无损伤。结论 FSHR32-44肽疫苗免疫小鼠后,无论低剂量还是高剂量对生殖器官及性激素不产生任何影响。     

中国人丙型肝炎病毒CTL多表位肽诱发的细胞免疫应答

目的:观察丙型肝炎病毒(HCV)C区、E区、NS3,NS4,NS5区的CTL模拟表位所诱导的细胞免疫.方法:用计算机预测的12条多肤体外刺激外周血单个核细胞,观察其增值情况,ELLSA方法检测培养上清中IFN-γ,水平的变化.结果:(1)NS4B(1793-1801)SMMAFSAAL和NS5 A(1991-1999)VISDFKVWL刺激HCV患者外周血单核细胞后,患者PBMC出现了明显的增值;(2)培养上清中的实验组IFN-γ水平明显高于阴性对照组.结论:预测的HCV CTL表位NS4B(1793-1801)NS5A(1991-1999)能够引起一定水平的细胞免疫.     

不同免疫途径对抗原肽修饰DC疫苗免疫效应的影响

目的探讨不同的免疫途径对抗原肽修饰树突状细胞(DC)疫苗免疫效果的影响。方法用鸡卵清蛋白(OVA)MHCⅠ限制性多肽SIINFEKL(OVAp257-264)包被小鼠骨髓来源的DC,通过皮下、腹腔、静脉或肌肉注射免疫小鼠,7天后行体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验(InvivoCTL)分析CTL杀伤活性和细胞内IFN-γ染色(ICS)分析免疫小鼠脾脏CD8+细胞产生IFN-γ的情况。结果免疫7天后,InvivoCTL结果显示SIINFEKL修饰的DC皮下、腹腔、静脉或肌肉注射免疫小鼠其特异性CTL杀伤效应分别是37.3%±7.3%、61.0%±4.2%、56.9%±3.6%和10.8%±2.3%;ICS结果示四组小鼠产生IFN-γ的CD8+细胞占总CD8+细胞的比例分别是0.31%±0.07%、0.85%±0.12%、0.76%±0.14%和0.15%±0.04%。结论不同免疫途径可明显影响抗原肽修饰DC疫苗的免疫效应,其中腹腔注射诱发的抗原特异性CTL反应最强,静脉注射者次之,而皮下注射特别是肌肉注射较弱,提示通过腹腔注射DC疫苗可能是安全、高效的免疫途径。     

树状串联hTERT表位肽负载mDC疫苗体外激发抗瘤免疫应答的效应研究

目的通过树状串联hTERT表位肽的髓样树突状细胞(mDC)递呈,刺激同源淋巴细胞,探索一种更优的肿瘤免疫治疗方法。方法人工固相合成4分支的树状串联hTERT表位肽(MAP)及其各分支单肽,免疫荧光检测hTERT的表达情况,免疫磁珠分选mDC,尼龙毛柱纯化T细胞,ELISA检测mDC的IL-12p70和淋巴细胞的(LC)TNF-α、IFN-γ分泌量,流式细胞技术检测mDC、LC的相关表面分子以及效应性T细胞对HLA-A2型肿瘤A549、MDA-MB-231和SW480的杀伤率,并作统计学分析。结果所有肿瘤细胞都表达hTERT,且胞核大于胞浆;MAP和混合单肽对3种肿瘤细胞都有杀伤效应,且MAP的杀伤效应大于混合单肽,有统计学差异。结论人工合成hTERT的MAP肽通过mDC能足够强的激活同源淋巴细胞,在肿瘤疫苗的研发中有重要意义。     

热休克蛋白gp96-肽复合物诱导的抗肿瘤免疫

目的: 用不同种类肿瘤提取的热休克蛋白 (HSP)gp96 肽复合物纯化后免疫动物,观察其诱导抗肿瘤免疫的效应,并初步探讨其机制。方法: 从肿瘤细胞中制备HSPgp96 肽复合物, 观察其免疫诱导作用。用不同剂量及不同来源的gp96 肽复合物免疫 6组小鼠后, 用H22癌细胞攻击, 观察各组小鼠的肿瘤发生率、瘤重及瘤组织的形态学变化并与对照组相比较。观察gp96 肽复合物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮 (NO)和杀瘤活性的影响。结果: 获得的纯化HSPgp96 肽复合物的Mr为 96 000。gp96 肽复合物的免疫效果与其剂量有关, 以 18μg/只的效果最明显。交叉免疫实验证明, 免疫小鼠能抵抗同种肿瘤细胞的攻击, 而对异种肿瘤细胞的则无免疫保护作用。gp96 肽复合物可刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO同时杀瘤活性增高。结论: 从肿瘤细胞中分离纯化的HSPgp96 肽复合物免疫小鼠后, 可获得特异性的抗肿瘤作用; 其对肿瘤细胞的杀伤作用与gp96 肽复合物能增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO增多有关。     

MUC1模拟表位肽致敏DC对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫微环境的影响

目的：研究黏蛋白1(MUC1)模拟表位肽致敏树突状细胞(DC)对宫颈癌荷瘤小鼠生长和免疫微环境的影响。方法：培养小鼠骨髓细胞,诱导并刺激DC成熟,MUC1模拟表位肽处理构建负载MUC1模拟表位肽的DC。构建稳定表达MUC1的宫颈癌U14细胞株的荷瘤BALB/c小鼠模型,随机分为3组：空白对照组(注射0.2 ml生理盐水)、DC组(注射2×10⁵个未加MUC1模拟表位肽的DCs)和DC+MUC1组(注射2×10⁵个负载MUC1模拟表位肽的DCs),免疫1周后进行二次免疫。治疗前和二次免疫1周后测量肿瘤体积;二次免疫1周后取小鼠肿瘤组织称重并计算抑瘤率;取小鼠外周血,流式细胞术检测CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg水平;ELISA检测小鼠血清IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF浓度。结果：与治疗前比较,空白对照组、DC组和DC+MUC1组肿瘤体积增大(P<0.0...     

CD8+ T细胞对HIV-1合成表位的免疫主导应答研究

目的研究CD8^＋ T细胞对人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）表位的免疫主导应答。方法分别采用酶联免疫斑点技术（ELtSPOT）和羧乙基锗倍半氧化物（CFSE）标记流式分析技术，以覆盖HIV-1 Env、Pol、Gag、Vif、Nef、Tat区的701个重叠肽段组成的34个肽段库及其部分单肽段作为刺激表位，对一例感染HIV-1的长期不进展者（LTNP）的外周血单个核细胞（PBMC）中CD8^＋ T细胞的了γ-干扰素（IFN-γ）分泌细胞频率和细胞增殖率进行了测定研究。结果HIV-1 Gag区域肽段诱导产生的CD8^＋ T细胞的IFN-γ分泌细胞频率最高，Nef、Tat、Vif区域依次顺减，Env和Pol区域不能诱导产生显著性应答；在IFN-γ ELISPOT实验中，肽段和相应肽段库刺激产生的结果一致；CD8^＋ T细胞在单肽段刺激下，用ELISPOT技术测定的IFN-γ分泌细胞频率和CFSE标记流式分析技术测定的细胞增殖率显示出较好的相关性。结论CD8^＋ T细胞能特异性识别某些HIV-1抗原表位，诱导出免疫主导应答；当进行HIV-1特异性CD8^＋ T细胞反应增殖测定和免疫主导应答研究时，ELISPOT是值得称道的标准实验，同时，推荐一种新颖的CFSE标记流式分析技术。     

双氢青蒿素对CpG ODN诱导小鼠RAW264.7细胞释放细胞因子的影响

目的：观察双氢青蒿素对CpG ODN诱导小鼠RAW264．7细胞释放细胞因子的影响。方法：体外培养小鼠RAW264．7细胞．用CpG ODN刺激小鼠RAW264．7细胞分泌TNF-α、IL-6,用不同浓度双氢青蒿素进行拮抗,ELISA法检测培养上清中促炎细胞因子的含量．结果：双氢青蒿素可抑制CpG ODN刺激小鼠RAW264．7细胞释放TNF—α和IL-6,并呈一定的量效关系,其中对IL-6最大抑制率可达到66．5％,而对TNF—α释放的最大抑制率仅为7．2％,其影响细胞因子释放的作用与细胞毒作用无关。结论：双氢青篙素呈浓度依赖性地抑制CpG ODN刺激小鼠RAW264．7细胞释放TNF—α和IL-6,但对TNF—α的影响较小。     

一种B型CpG ODN对乙肝疫苗的免疫佐剂作用

目的 研究一种本室设计的B型CpG ODN(BW006)作为乙肝疫苗佐剂的可行性.方法 以琼脂糖凝胶电泳法对BW006的质量进行初步检定;H3-掺人法检测BW006对小鼠脾细胞的刺激作用;乙肝疫苗与BW006联合免疫Balb/c小鼠,并用ELISA法检测小鼠血清中的HBsAb水平.结果 BW006的纯度和完整性符合实验要求,并能显著的刺激小鼠脾细胞的增生,同乙肝疫莳联用后能够明显增强乙肝疫苗的免疫效果.结论 BW006对乙肝疫苗有较强的免疫佐剂作用.     

三类细菌基因组和CpG ODN作为禽流感病毒H5N1亚型灭活油乳苗佐剂的研究

目的：通过两种免疫策略比较三类细菌基因组和CpG ODN对禽流感病毒（AIV）H5N1灭活油乳苗的影响。方法：苯酚氯仿法抽提革兰氏阴性致病菌（大肠杆菌O2）、阳性致病菌（金黄色葡萄球菌）和阳性益生菌（粪链球菌FQ68）的基因组,并人工合成CpG ODN作为AIV油乳苗的佐剂,分佐剂与油苗分开和油裹于油苗内两种途径免疫鸡群,检测血凝（HI）抗体效价、HA抗原特异性IgG效价、IL-10和IFN-γ浓度。结果：当佐剂与油苗分开免疫时,各佐剂在所有的时间点上削弱（P〉0.05）或者显著地削弱（P〈0.05）HI和血清IgG效价,稍稍提高IL-10和IFN-γ浓度（P〉0.05）;当佐剂油裹于油苗里时,CpG ODN和FQ68基因组在所有的时间点上提高（P〉0.05）或者显著地提高（P〈0.05）HI和IgG效价以及IFN-γ浓度,其中CpG ODN好于FQ68基因组,但是都降低了IL-10浓度。结论：当CpG ODN或FQ68基因组油裹在AIV油乳苗里时能提高体液、Th1型免疫水平;当佐剂和油苗分开免疫时,则免疫佐剂性不佳。     

CpG ODN对rHBsAg免疫小鼠脾细胞周期与凋亡的影响

目的：研究合成含CpG基序的寡脱氧核苷酸（CpGODN）对重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg）免疫小鼠脾淋巴细胞细胞周期及细胞凋亡的效应。方法：采用BALB／c小鼠作为免疫实验动物，经后腿胫骨前肌免疫两次，FACS法检测脾细胞的细胞周期与细胞凋亡。结果：FACS检测结果显示，加CpGODN各组与不加CpGODN相应组比较，脾细胞细胞周期明显由G0／G1期向S期转化；细胞凋亡则呈现降低趋势。结论：CpGODN可以有效刺激免疫小鼠脾淋巴细胞细胞周期由G0／G1期向S期转化，并且有抑制细胞凋亡的效应。     

新型CpGODN对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的:探讨我室自行设计的CpG ODN(CpG BW001)在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用.方法:CpG BW001刺激人外周血单个核细胞(PBMC)48小时,用VSV病毒保护实验及ELISA法检测培养上清的病毒保护能力及其中的IFN-α含量.将上述CpG BW001刺激人PBMC的上清与HepG2.2.15细胞共孵育12天后收集培养上清,用放射免疫法检测该培养上清液中HBsAg及HBeAg的含量,用点杂交法检测HBV DNA的含量.结果:CpG BW001刺激人PBMC产生以IFN-α为主的抗病毒物质;CpG BW001刺激人PBMC的培养上清作用于HepG2.2.15细胞后,HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量明显减少,且细胞内HBV DNA的含量也显著降低.结论:CpG BW001能通过刺激细胞产生抗病毒物质如IFN-α等,从而在体外抑制HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制.     

CpG ODN佐剂促进HBsAg疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的探讨

目的 探讨cpG ODN对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法HBsAg和HBsAg＋CpG ODN分别肌肉注射免疫Balb／c小鼠后,从淋巴组织（脾和淋巴结）和非淋巴组织（肺）分离淋巴细胞,体外经HBsAg抗原刺激后,利用ELISA检测细胞培养液中IFN-γ的水平,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ^＋细胞的频率,分析IFN-7^＋细胞亚群。结果对照组和HBsAg免疫组IFN-γ产生的水平很低,当HBsAg加强免疫1～2次后,IFN-γ表达仍然没有明显升高;而CpG ODN＋HBsAg免疫1次或加强免疫后,CpG显著促进HBsAg诱导的IFN-γ产生。进一研究结果表明CpG促进HBsAg诱导淋巴器官和非淋巴器官内CD4^＋和CD8^＋T细胞IFN-γ的表达。结论CpG免疫佐剂不仅能诱导细胞免疫应答同时也诱导体液免疫应答,提示CpG ODN可以用于HBsAg预防和治疗性佐剂。     

CpG ODN促进树突状细胞成熟的实验研究

目的：研究CpG ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow—derived dendritic cells,BMDC)分化成熟的影响。方法：以含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(unmethylated CpG motif containing oligonucleotides,CpG ODN)刺激BMDC，流式细胞术检测DC膜表面CD80表达，ELISA检测DC分泌IL-l2水平，MTT法测定CpG ODN活化的DC刺激T细胞培殖能力。结果：CpG ODN可显著刺激DC表达CD80，分泌IL-l2，增强DC刺激T细胞增殖的能力。结论：CpG ODN可以有效促进DC的功能成熟。     

CpG ODN enhances uptake of bacteria by mouse macrophages

Unmethylated CpG motif in synthetic oligodeoxynucleotide (CpG ODN) or bacterial DNA is well recognized for its role in innate immunity, including enhancing production of NO and cytokines by macrophages. In the present study, we demonstrated the effect of CpG ODN on the phagocytic uptake of bacteria by macrophages. Flow cytometric analysis of mouse macrophages (RAW 264.7) incubated with fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled Burkholderia pseudomallei, Salmonella enterica serovar Typhi or Escherichia coli showed that CpG ODN increased the uptake of these bacteria by mouse macrophages. The enhancement of bacterial uptake by CpG ODN was concentration-dependent. The increase of bacterial uptake by CpG ODN-activated macrophages shown above is consistent with the result of bacteria internalization study using a standard antibiotic protection assay. There was also an increase in the rate and degree of multi-nucleated giant cell formation, phenomena which have been shown previously to be unique when the cells were infected with B. pseudomallei. These observations may provide significant insights for future investigation into host cell-pathogen interaction.     

中和抗体识别短肽对IFN-α生物学活性的影响

目的研究合成肽ＷＬＤＰＲＨ的免疫反应性和对干扰素（ＩＦＮ）诱导的生物学活性的影响。方法根据我们早先的研究，已用中和抗体从噬菌体展示６肽库中筛选出了两个与ＩＦＮ－α有同源性的肽片段，将其中之一进行了人工合成（ＷＬＤＰＲＨ），并进行了同源性比较分析，体外竞争酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ），体外ＩＦＮ诱导抗病毒和抗增殖分析。结果计算机分析表明，人工合成肽ＷＬＤＰＲＨ与推理的Ｉ型ＩＦＮ受体结合区ＬｏｏｐＡＢ（２９－３５位）有相当的同源性。体外竞争ＥＬＩＳＡ实验表明，合成肽在２５μｇ／ｍｌ浓度时能特异性抑制ＩＦＮ－α与中和抗体４Ｃ１结合。体外抗病毒结果显示，干扰素在亚保护剂量时（２０～７０ｐｇ／ｍｌ）时，合成肽能提高ＩＦＮ－α作用细胞后的抗病毒活性，并且合成肽ＷＬＤＰＲＨ在１．４μｇ／ｍｌ时，ＩＦＮ－α抗病毒保护率从４０％提高到８６％，为最高保护率的最低剂量，但合成肽为１．４μｇ／ｍｌ，ＩＦＮ浓度为５～５５ｎｇ／ｍｌ时，对ＩＦＮ－α诱导的抗增殖作用不明显。结论用中和抗体筛选的短肽ＷＬＤＰＲＨ能影响ＩＦＮ分子作用模式，并且有可能模拟ＩＦＮ分子ＬｏｏｐＡＢ的结构和功能，这为免疫治疗及ＩＦＮ的小分子模拟设计奠定基础。     

CpG ODN activates NO and iNOS production in mouse macrophage cell line (RAW 264.7)

Synthetic CpG containing oligodeoxynucleotide (CpG ODN) is recognized for its ability to activate cells to produce several cytokines, such as IL-12 and TNF-alpha. In the present study we have demonstrated that CpG ODN 1826, known for its immunostimulatory activity in the mouse system could, by itself, induce nitric oxide (NO) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) production from mouse macrophage cell line (RAW 264.7). Neutralizing antibody against TNF-alpha was not able to inhibit NO or iNOS production from the CpG ODN 1826-activated macrophages, suggesting that although the TNF-alpha was also produced by CpG ODN-activated macrophages, the production of iNOS was not mediated through TNF-alpha. Although both CpG ODN 1826 and lipopolysaccharide (LPS) were able to stimulate NO and iNOS production, the exposure time required for maximum production of NO and iNOS for the CpG ODN 1826-activated macrophages was significantly longer than those activated with LPS. These results were due probably to a delay of NF-kappaB translocation, as indicated by the delay of IkappaBalpha degradation. Moreover, the fact that chloroquine abolished NO and iNOS production from the cells treated with CpG ODN 1826 but not from those treated with LPS suggested that the induction of NO and iNOS production from the cells stimulated with CpG ODN (1826) also required endosomal maturation/acidification.