沉默ClC-3氯通道基因对HeLa细胞周期分布的影响

目的:探讨沉默HeLa细胞的ClC-3氯通道基因后细胞周期分布的变化及其作用机制。方法:依照siRNA设计原则构建沉默ClC-3基因的ClC-3 siRNA并转染HeLa细胞;实验分为空白对照组(control组)、转染试剂对照组(Lipo组)、阴性对照组(negative siRNA组)和ClC-3 siRNA组。采用real-time PCR检测ClC-3 siRNA的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期分布情况;Western blot检测ClC-3蛋白及相关细胞周期蛋白(cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4、CDK6、P21和P27等表达。结果:CIC-3 siRNA成功沉默HeLa细胞的ClC-3基因。和其它组相比,ClC-3 siRNA组的细胞周期被阻抑在G_0/G_1期。CIC-3 siRNA组的cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达水平明显下降,P21和P27蛋白表达水平明显上升。结论:沉默HeLa细胞ClC-3氯通道基因可影响cyclin D1、CDK4、CDK6、P21和27蛋白的表达水平胆抑HeLa细胞周期停滞在G_0/G_1期。     

ClC-3氯通道过表达对小鼠甲状腺结构及功能的影响

目的:研究过表达Cl C-3基因对小鼠甲状腺结构及功能的影响。方法:以3月龄FVB小鼠为实验对象,研究野生型(WT)小鼠和Cl C-3转基因小鼠甲状腺结构及功能的差异。用q PCR、Westren blot和免疫荧光技术观察小鼠甲状腺Cl C-3的表达与分布;对小鼠日常活动进行行为学监测;ELISA检测小鼠血清总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)和促甲状腺激素(TSH)的浓度。结果:与WT组小鼠相比:Cl C-3转基因组小鼠甲状腺Cl C-3表达明显增多(P0.05);甲状腺表现为明显的增生,滤泡明显增大;体重减轻但摄食量增加(P0.05),毛发无光泽,行为活跃,易激惹;TT3、TT4明显增高(P0.05),但TSH变化不明显。结论:Cl C-3过表达可导致甲状腺组织增生,甲状腺激素分泌增多。本研究提示Cl C-3很可能参与了甲状腺激素的合成。     

ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展

细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程,如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等[1, 2].在低渗环境刺激下,容积激活性氯通道参与细胞容积调节,对维持细胞容积起着重要调节作用.     

ClC-3氯通道蛋白调控细胞增殖机制的研究进展

Cl C-3是电压门控性氯离子通道家族的成员,主要作为容积激活性氯通道通过调节容积激活性氯电流[Cl,（vol）],调节细胞体积,细胞膜电位等影响细胞增殖。近年的研究发现Cl C-3也可通过调节有丝分裂前凝集（premitotic condensation,PMC）过程,或维持细胞囊泡酸化和细胞内氧压,或作为调控因子通过Akt-GSK-3β信号通路和Ca MKII调节的信号通路等途径参与细胞增殖的调控。     

ClC-3氯离子通道对高分化鼻咽癌细胞突起形成的影响

目的：探讨ClC-3氯离子通道在高分化鼻咽癌CNE-1细胞突起形成中的作用。方法：采用免疫荧光技术（Alexa Fluor 488标记抗体）检测CNE-1细胞中ClC-3蛋白的分布;MQAE荧光探针检测细胞内氯离子浓度;吸附式单通道膜片钳技术记录氯离子单通道活动;采用FAM标记的siRNA转染细胞,实验分为对照组、阴性对照（NC） siRNA组和ClC-3 siRNA组;激光共聚焦显微镜观察转染后绿色荧光情况,流式细胞术检测转染效率,Western blot法测ClC-3蛋白的表达,倒置显微镜下观察CNE-1细胞突起形成情况。结果：ClC-3蛋白主要分布于细胞膜和细胞质,且在细胞膜突起形成部位明显聚集;细胞突起处MQAE荧光弱,氯离子浓度较高,而突起根部荧光强,氯离子浓度较低;突起根部记录到翻转电位为4.06 mV的单通道电流,在-120 mV钳制电压下,该通道电导约为78.4pS; siRNA转染细胞48 h后,ClC-3 siRNA组细胞ClC-3蛋白表达量显著降低（P<0.01）,且ClC-3 siRNA组细胞无片状伪足伸出,而对照组和NC siRNA组细胞伸出明显的片状伪...     

氯通道ClC-2融合蛋白的原核表达及体外磷酸化

目的：检测ClC-2是否能被促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，为进一步研究其在细胞增殖、分化过程中的调控机制提供基础。方法：从含有家兔ClC-2cDNA的质粒pSPORT1中PCR扩增ClC-2胞浆内的羧基端DNA编码序列，构建重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，通过Gluthathion Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白；并行融合蛋白的体外磷酸化实验。结果：酶切、测序鉴定重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT构建正确，并纯化得到GST／ClC-2CT融合蛋白。而且该融合蛋白能被MAPK磷酸化，而GST不能被MAPK磷酸化。结论：氯通道ClC-2能被MAPK磷酸化。     

敲低IK1钾通道抑制ClC-3氯通道的表达和功能

 目的: 探讨ClC-3氯通道是否为IK1钾通道的调节靶点,重点研究鼻咽癌细胞IK1钾通道对ClC-3氯通道功能及蛋白表达的影响。方法: 采用siRNA转染技术抑制低分化鼻咽癌上皮细胞(CNE-2Z) IK1 基因的表达;real-time PCR技术检测ClC-3 mRNA的表达;Western blot检测ClC-3的蛋白表达;细胞免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术检测ClC-3和IK1蛋白在细胞内分布;全细胞膜片钳记录细胞氯电流。结果: IK1 siRNA可以成功转染CNE-2Z细胞,有效抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达;用IK1 siRNA抑制鼻咽癌细胞IK1钾离子通道的表达后, ClC-3的mRNA表达上调而ClC-3蛋白却表达减少:在低分化鼻咽癌上皮细胞,低渗刺激可激活氯通道,产生一个较大的氯电流,在成功转染IK1 siRNA的细胞,此氯电流明显减弱。结论: 敲低IK1钾离子通道可抑制ClC-3氯离子通道的表达和功能。     

天麻钩藤饮对SHR血清Ca2+浓度及血管平滑肌细胞钙通道的影响

目的：探讨天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠(SHR)的血管平滑肌细胞钙通道电生理特征的影响，以期进一步阐明天麻钩藤饮对血压干预的作用机制。方法:选用12周龄自发性高血压雄性大鼠45只，随机分为5组，即天麻钩藤饮组（A组）、天麻钩藤饮去石决明组（B组）、硝苯地平组（C组）、石决明组（D组）、生理盐水对照组（E组）。治疗4周后，测定血清游离钙浓度；用全细胞模式膜片钳技术记录分析血管平滑肌细胞L型电压依赖性钙通道的特性。结果:用药前后天麻钩藤饮组和硝苯地平组血清游离钙浓度改变没有统计学意义(P>0.05)，天麻钩藤饮去石决明组、石决明组、生理盐水组血清游离钙浓度低于用药前 (P<0.05) ，以生理盐水组最明显(P<0.01)。天麻钩藤饮组、硝苯地平组有明显减少血管平滑肌细胞ICa-L内流的作用，石决明组作用较弱，天麻钩藤饮去石决明组、生理盐水组没有减少血管平滑肌细胞ICa-L内流的作用。结论:天麻钩藤饮可以提高血清游离钙离子浓度。天麻钩藤饮有明显的阻滞血管平滑肌细胞L型钙离子通道的作用，这可能是其降压作用机制之一。     

CX3CR1通过调节Ca2+内流介导神经元凋亡影响缺血性卒中小鼠预后

目的观察脑缺血后趋化因子受体1(CX3CR1)在神经元上的表达变化,并探讨其作用及机制。方法将野生型C57/BL6小鼠和CX3CR1基因敲除小鼠,分别设置对照组(假手术组)和小鼠中动脉永久闭塞(pMCAO)模型,用磁共振成像(MRI)检测30 min后脑缺血范围和24 h后梗死面积;免疫荧光三重染色法检测凋亡;Western blot检测CX3CR1蛋白的表达。在体外,培养原代神经元,建立氧糖剥离(OGD)细胞缺血模型;用MTT法检测细胞存活率;免疫荧光检测神经元CX3CR1的表达;激光共聚焦显微镜观察神经元内Ca^2+浓度变化。结果在野生型小鼠中,与对照组和健侧相比,pMACO后,患侧CX3CR1表达显著升高(P<0.05),且CX3CR1与凋亡蛋白caspase-3在神经元上共表达;与野生型小鼠相比,CX3CR1基因敲除小鼠pMACO 30 min后缺血损伤面积相似,但24 h后CX3CR1基因敲除小鼠梗死面积小于对照组(P<0.05);在体外,原代神经元OGD后CX3CR1表达显著升高(P<0.05),敲除神经元上CX3CR1,可减轻谷氨酸介导的兴奋性损伤,细胞存活率显著上升,同时观察到,敲除CX3CR1可降低谷氨酸介导的Ca^2+内流到神经元的速度和总量。结论缺血可诱导神经元CX3CR1的表达,且神经元CX3CR1可以通过调节Ca^2+内流来介导神经元的凋亡。     

电压门控氯通道3（ClC-3）的生物学作用及其与疾病的关系

ClC-3属于电压门控氯通道家族,存在于细胞膜和细胞质,以及某些肿瘤细胞的细胞核内,高表达于中枢神经系统、肾脏和肠道。ClC-3参与离子转运、容积调节、免疫应答、细胞迁移、增殖、分化、凋亡等生理生物学活动,近年发现ClC-3与肿瘤、糖尿病等疾病的发生密切相关。     

UTP对猪冠状动脉平滑肌细胞BK_(Ca)通道作用机制的研究

目的:利用膜片钳技术,研究UTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa通道的作用,探讨生理条件下UTP调节BKCa通道的机制。方法:应用Cell-attached技术记录急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa电流。用pCLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在Cell-attached膜片上,80μM UTP可明显激活BKCa通道(P0.05,n=21)。PLC抑制剂U73122可抑制UTP对BKCa的激活作用(P0.05,n=5)。PKC激动剂PMA(10nM),可使BKCa通道开放概率明显降低(P0.05,n=9)。UTP(80μM)预处理细胞之后,IP3抑制剂2APB(80μM),可使BKCa通道开放受抑(P0.05,n=6)。结论:在Cell-attached膜片上,UTP能激活猪冠脉平滑肌细胞BKCa通道。PLC信使转导通路中的IP3介导的胞内Ca2+释放是UTP激活BKCa通道的重要途径。     

心房颤动时心房肌细胞L型Ca2+通道与肌浆网间Ca2+信号转导的探讨

目的：探讨房颤时心房肌细胞膜上L型Ca2+通道与肌浆网之间的Ca2+信号转导。 方法： 杂种犬10条，随机分为正常对照组和单纯房颤组。房颤组用起搏器行右心房快速起搏（500±20）次/分，术后观测24周。正常对照组不植入起搏器。胶原酶Ⅱ型分离心房肌细胞，用激光共聚焦显微镜检测L型Ca2+ 通道对细胞内Ca2+浓度变化的影响；L型Ca2+通道与肌浆网三磷酸肌醇受体（IP3R）和兰尼碱受体（RyR）之间的Ca2+信号转导。 结果： （1）L型Ca2+通道与肌浆网IP3R之间的Ca2+信号转导：正常对照组、单纯房颤组的心房肌细胞在用mibefradil和丁卡因分别阻滞T型Ca2+通道和RyR后给予细胞膜激动剂时，细胞内Ca2+浓度均升高（分别为1.4000±0.0776和1.5169±0.4414），组间比较无显著差异（P＞0.05）；（2）L型Ca2+通道与肌浆网RyR之间的Ca2+信号转导：正常对照组的心房肌细胞在用mibefradil和肝素分别阻滞T型Ca2+通道和IP3R后给予细胞膜激动剂时，细胞内Ca2+浓度升高（1.5576±0.1989），单纯房颤组的细胞内Ca2+浓度也升高（1.5372±0.2952），两组间比较无显著差异（P＞0.05）。 结论： 房颤时L型Ca2+通道与RyR和IP3R之间可能存在信号转导，但其可能在房颤时的细胞内Ca2+超载及异常Ca2+信号转导方面不起重要作用。     

ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用

目的:探讨ClC-3氯通道在二甲双胍抑制鼻咽癌细胞周期进程中的作用。方法:采用不同浓度二甲双胍处理低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot法检测ClC-3氯通道蛋白表达,全细胞膜片钳技术检测细胞氯电流。构建高表达ClC-3氯通道蛋白的质粒pEZ-M03-ClC-3转染CNE-2Z细胞,流式细胞术检测ClC-3氯通道对细胞周期分布的影响。结果:5、10和20 mmol/L浓度的二甲双胍均可有效抑制CNE-2Z细胞的活力。10 mmol/L二甲双胍可阻抑CNE-2Z细胞周期于G₀/G₁期,并抑制CNE-2Z细胞氯电流及ClC-3氯离子通道蛋白的表达。ClC-3氯通道蛋白高表达可逆转二甲双胍对CNE-2Z细胞周期分布的影响。结论:二甲双胍抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞周期进程可能与抑制ClC-3氯通道功能和蛋白表达有关。     

干姜吴茱萸水煎液对大鼠结肠平滑肌细胞L型Ca2+通道的影响

目的：探讨干姜吴茱萸水煎液对大鼠结肠平滑肌收缩及平滑肌细胞L型Ca²⁺通道的影响机制。方法：采用0、0.01、0.1、1、10 g/L干姜吴茱萸(1∶1)水煎液依次作用于正常结肠平滑肌,10 g/L水煎液及L型Ca²⁺通道激动剂BAY-K-8644依次作用于氯化乙酰胆碱(Ach)诱导后的正常平滑肌,检测平滑肌收缩张力、频率和振幅;全细胞膜片钳记录L型钙电流;Western blot检测各组细胞中L-型电压依赖钙离子通道α1C亚基(α1c)和钙调蛋白(CaM)蛋白表达情况。结果：1、10 g/L水煎液组能显著降低离体结肠平滑肌的收缩张力(P<0.05),对频率及振幅并无显著影响(P>0.05);与0 g/L水煎液组相比,Ach促进平滑肌收缩张力、频率和振幅显著增加(P<0.05);与Ach组相比,10 g/L水煎液显著降低平滑肌的收缩张力、频率和振幅(P<0.05);与10 g/L水煎液组相比,BAY-K-8644显著增加平滑肌的收缩张力、频率和振幅(P<0.05);与0 g/L水煎液组相比,Ach可显著增加ICa...     

Ca2+与内质网途径的细胞凋亡

细胞Ca2+稳态的维持主要是通过内质网进行的，Ca2+在细胞内的活动多与内质网有关，胞内\[Ca2+\]的变化可以引起内质网应激，而过度的内质网应激则会导致细胞的凋亡。由于内质网和线粒体在细胞内空间结构上的接近，内质网释放的Ca2+又会引起线粒体途径的凋亡。一些内质网相关的因素也参与Ca2+所引起的细胞内质网途径的凋亡。     

NMDAR1单克隆抗体抑制谷氨酸诱导的大鼠海马神经元Ca2+内流

目的观察人N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR,NR)主亚基(NR1)单克隆抗体mAbN1对谷氨酸诱导的大鼠海马神经元Ca2 内流的影响。方法建立谷氨酸介导的大鼠海马神经元兴奋毒性损伤模型,以mAbN1及MK-801分别预处理海马神经元,用Fluo-3/AM法,在激光扫描共聚焦显微镜下观察对细胞内游离Ca2 浓度([Ca2 ]i)的影响。结果mAbN1能显著抑制谷氨酸所致海马神经元[Ca2 ]i升高,此作用强于MK-801,且其本身对生理状态下神经元[Ca2 ]i无影响。结论mAbN1的抗兴奋毒性作用可能是通过改变NR的蛋白质二级结构从而影响兴奋毒性作用中的Ca2 内流实现的。     

内源性一氧化氮对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞钾通道的影响

目的：观察体内应用一氧化氮（NO）前体左旋精氨酸（L-Arg）对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞（BSMC）钾通道电生理特性的影响，为哮喘治疗提供理论基础。 方法： 雄性SD大鼠，随机分为对照组、哮喘组和哮喘L-Arg(300 mg/kg)治疗组（L-Arg组）。急性酶消化法分离获得大鼠单个BSMC。用常规全细胞膜片钳技术记录3组BSMC的静息膜电位（Em）、钙激活钾通道(BKCa)电流和电压依赖性钾通道（Kv）电流的差异。 结果： （1）哮喘组的静息膜电位为(-29.4±5.6) mV，显著低于对照组(-34.8±6.2)mV, (P<0.05)；L-Arg治疗组的静息膜电位为(-36.1±6.8) mV, 与哮喘组差异显著(P<0.05)。（2）钙激活钾通道电流：+50 mV电压刺激时，方波刺激模式下哮喘组大鼠BSMC的BKCa峰值电流密度［(43.8±16.5) pA/pF, n=8］低于对照组［(72.5±19.9)pA/pF, n=8］,(P<0.01)；L-Arg组的BKCa电流密度［(58.7±12.4) pA/pF, n=8］则高于哮喘组(P<0.05)。（3）电压依赖性钾通道电流：+50 mV电压刺激时，方波刺激模式下哮喘组大鼠BSMC的Kv峰值电流密度为［(32.4±8.7)pA/pF, n=8］，显著低于对照组［(57.7±9.8)pA/pF, n=8］ (P<0.01)；L-Arg组的Kv峰值电流密度［(43.6±7.9)pA/pF, n=8］，显著高于哮喘组［(32.4±8.7)pA/pF, n=8］ (P<0.05)。结论： 体内应用L-Arg可增加钙激活钾通道和电压依赖性钾通道电流，明显改善哮喘大鼠BSMC的静息膜电位，从而降低气道平滑肌细胞的兴奋性，可能具有抑制气道高反应性的作用。     

SeO2诱导白血病细胞凋亡过程中对细胞内活性氧和Ca2+水平影响

目的：研究SeO2对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4、红白血病细胞K562、急性粒细胞白血病细胞株HL-60的增生、凋亡、活性氧(ROS)及Ca2+水平等的影响。 方法： 采用不同浓度SeO2（3-30 μmol/L）分别处理3种白血病细胞，用流式细胞术测定细胞凋亡率、细胞中ROS和Ca2+的水平。 结果： 10和30 μmol/L SeO2能抑制3种细胞增生，30 μmol/L SeO2作用48 h能使54.0%的NB4细胞、46.5%的K562细胞和49.6%的HL-60细胞发生凋亡。同时下调细胞内ROS和Ca2+水平。NB4和HL-60细胞中ROS阳性细胞比例随SeO2浓度增加而减少，K562中只有30 μmol/L SeO2才能使ROS出现明显下降。10、30 μmol/L SeO2能使NB4和HL-60细胞内Ca2+水平逐步下降。K562中只有30 μmol/L SeO2才能使细胞内Ca2+水平出现明显下降。 结论： SeO2对3种白血病细胞均有诱导凋亡作用，在凋亡过程中涉及细胞内ROS及Ca2+水平下降。     

糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞BK_(Ca)通道的变化

目的:探讨糖尿病胃轻瘫(DGP)的发病机制与胃平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(BKCa)变化之间的关系。方法:将大鼠分为对照组和糖尿病胃轻瘫模型组。应用木瓜蛋白酶液急性酶分离大鼠胃平滑肌细胞,采用单通道膜片钳技术记录大鼠胃平滑肌细胞BKCa电流,免疫组织化学技术测定BKCa蛋白KCNMA和KCNMB1的表达。结果:大鼠胃平滑肌细胞BKCa电流的开放具有电压依赖性和胞内钙离子浓度依赖性,可被钾离子通道阻滞剂Ib TX阻断;模型组大鼠胃平滑肌细胞BKCa开放概率及开放幅度增加(P0.05),平均开放时间及平均关闭时间减少(P0.01);模型组大鼠胃平滑肌细胞KCNMB1蛋白表达增加(P0.01),KCNMA蛋白表达无明显变化。结论:DGP发病与胃平滑肌细胞BKCaβ1亚基蛋白表达上调及通道功能活动增强有关,β1亚基蛋白可能通过调节BKCa功能活动参与DGP的发生。