大鼠骨骼肌成肌细胞与乳鼠心肌细胞共培养对缝隙连接蛋白43表达的影响

目的 观察体外共培养的乳鼠心肌细胞与大鼠骨骼肌成肌细胞(简称L6细胞)以及乳鼠心肌细胞与转染外源性缝隙连接蛋白43(Cx43)基因的L6细胞(简称L6-Cx43细胞)间Cx43蛋白的表达情况,从而探讨共培养时心肌环境对成肌细胞的作用.方法 将乳鼠心肌细胞与4′,6-二脒基-2-苯基吲哚标记的大鼠骨骼肌成肌细胞进行共培养...     

α_2-肾上腺素能受体激动剂B-TH933抑制LPS处理的心肌细胞释放TNF-α

目的:观察α2-肾上腺素能受体激动剂B-HT933对脂多糖(LPS)刺激的心肌细胞产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响,并初步分析其作用机制。方法:分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞。利用免疫荧光染色观察心肌α2A-肾上腺素能受体的分布;B-HT933和/或LPS处理心肌细胞一定时间后,用ELISA方法检测细胞培养液中TNF-α的含量、实时荧光定量PCR测定心肌细胞TLR4和TNF-αmRNA的表达、Western blot分析心肌细胞中相关信号分子的磷酸化水平。结果:免疫荧光染色证实乳鼠心肌细胞中存在α2A-肾上腺素能受体。LPS以剂量和时间依赖的方式刺激心肌细胞产生TNF-α,0.1μmol/L的B-HT933处理能显著抑制LPS诱导的TNF-αmRNA的表达和TNF-α蛋白的产生。而且,BHT能抑制LPS诱导的心肌细胞IκBα的磷酸化。结论:乳鼠心肌细胞上存在α2A-肾上腺素能受体,其激动剂B-HT933可能通过抑制心肌细胞IκBα的磷酸化来减少LPS诱导的TNF-α产生。     

益母草水苏碱对去甲肾上腺素诱导乳鼠心肌细胞肥大钙摄取的影响

<正>目的:观察益母草水苏碱对去甲肾上腺素诱导的乳鼠心肌细胞肥大效应的抑制作用,探讨益母草水苏碱对心肌细胞肥大后Ca2+摄取的调节作用。方法:采用II型胶原酶分离乳鼠心室肌细胞,以及去甲肾上腺素诱导模拟心肌细胞肥大反应。通过细胞表面积、Protein/DNA比值、胚胎基因再表达,观察益母草水苏碱对     

美托洛尔对心力衰竭大鼠心肌细胞磷酸化缝隙连接蛋白43表达及心肌细胞凋亡的影响

 目的：观察美托洛尔对心力衰竭（HF）大鼠在体心肌组织磷酸化缝隙连接蛋白43（p-Cx43）表达水平和心肌细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法：SD大鼠100只随机分为5组（n=20）：假手术（sham）组、HF组、小剂量（1.25 mg·kg-1·d-1）美托洛尔治疗（MetoA）组、中剂量（5 mg·kg-1·d-1）美托洛尔治疗（MetoB）组和大剂量（20 mg·kg-1·d-1）美托洛尔治疗（MetoC）组。缩窄腹主动脉建立HF动物模型,术后第4周开始给药至第8周。术后第4周和第8周超声心动图测定血流动力学指标;术后第8周取出心脏,HE和Masson染色观察心脏结构改变和胶原纤维增生情况,Western blotting检测p-Cx43表达水平,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,p-Cx43表达水平与心肌细胞凋亡指数进行Pearson相关分析。结果：(1) 美托洛尔治疗改善HF大鼠血流动力学,在治疗剂量范围内美托洛尔剂量增加可有效逆转HF时的心肌重塑,呈剂量依赖效应。(2) HF组中p-Cx43表达量显著高于sham组（P<001）,而随美托洛尔治疗剂量的增加,p-Cx43表达量较HF组逐渐降低,各治疗组间两两比较亦有显著差异（P<001）。(3) HF组心肌细胞凋亡指数［(51.17±6.94)%］较sham组［(4.62±1.60)%］明显增加（P<001）;MetoA组凋亡指数为(40.60±4.15)%, MetoB组凋亡指数为(30.66±4.00)%,MetoC组凋亡指数为(22.24±5.69)%,均显著低于HF组（P<001）,各治疗组间两两比较亦有显著差异（P<001）。(4) 大鼠心肌组织p-Cx43表达水平与心肌细胞凋亡指数呈显著正相关（r=0.905, P<001）。结论: 美托洛尔对抗HF诱导的心肌细胞凋亡的机制可能与其抑制p-Cx43表达有关。     

缝隙连接蛋白43和黄体生成素受体在小鼠卵巢中的表达

目的 观察小鼠卵泡发育过程中缝隙连接蛋白43（Cx43）和黄体生成素受体（LHR）在小鼠卵巢中的表达以及黄体生成素(LH)对卵巢Cx43表达的影响,为这两种分子与卵泡发育的关系提供实验依据。 方法 选择出生后1d、4d、7d、2周、3周、4周、6周、8周龄雌性C57小鼠共8组,每组10只,取卵巢。HE染色观察卵巢形态、卵泡发育并测量颗粒细胞体积分数。免疫组织化学和Western blotting观察卵巢组织中Cx43及LHR的表达,Western blotting检测不同浓度黄体生成素（LH）孵育后对卵巢Cx43表达的影响。 结果 HE染色显示,出生1d小鼠卵巢中见原始卵泡,出生7d卵巢内出现初级卵泡,2周时出现窦前卵泡和少量窦卵泡,3周、4周时,出现较多大的窦卵泡,6～8周时出现黄体。卵泡颗粒细胞体积分数在2周后的卵巢中明显增加。Cx43表达在各阶段卵泡的颗粒细胞胞膜上,LHR表达在卵泡膜细胞、颗粒细胞及卵母细胞胞质中。Cx43和LHR出生后2周卵巢中的表达开始明显增加,并随卵泡发育表达逐渐增强,在3周、4周、6周和8周维持相对较高水平。LH体外干预可增加卵巢组织Cx43的表达。 结论 Cx43和LHR在卵泡发育中发挥重要作用,LH可能通过LHR促进卵巢卵泡颗粒细胞Cx43的表达。     

肾上腺髓质素对内毒素性休克大鼠心肌细胞β-肾上腺素受体激动剂反应性的影响

目的: 研究肾上腺髓质素(ADM)对内毒素性休克大鼠心肌细胞β-肾上腺素受体激动剂反应性的影响。方法: 成年SD大鼠腹腔注射脂多糖(LPS 10 mg/kg) 4 h后,分离心室肌细胞。用细胞缩短的方法观察ADM对心肌收缩的影响。以细胞内cAMP的水平为指标,研究ADM对内毒素性休克大鼠心肌细胞β-肾上腺素受体激动剂反应性的影响。结果: 休克心肌细胞细胞缩短程度较正常心肌细胞明显减弱。ADM孵育心肌细胞时间超过60min具有明显的负性肌力作用。特异性ADM受体拮抗剂ADM-(22-52)可取消上述两种负性肌力作用。休克心肌细胞cAMP基础水平较正常心肌细胞降低(P<0.05)。与正常对照组比较,用1 μmol/L异丙肾上腺素(Iso)刺激内毒素性休克大鼠的β-肾上腺素受体, cAMP的增加明显减少(P<0.01)。1 μmol/L forskolin 增加cAMP的作用在2组间没有显著变化(P>0.05)。ADM-(22-52)可使内毒素性休克时心肌细胞对β-肾上腺素受体激动剂降低的反应性得到恢复。结论: 内毒素性休克时过量产生的ADM使大鼠心肌细胞收缩减弱,有可能是ADM使大鼠心肌细胞对β-肾上腺素受体刺激的反应性降低所致。     

过氧化氢对乳鼠心肌细胞核仁结构的损伤及HSP70的保护作用

目的采用体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞为模型,观察过氧化氢(H2O2)对心肌细胞核仁结构的损伤作用以及HSP70对核仁结构改变的保护作用.方法向体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞中加入含0.5mmol/LH2O2的无血清DMEM培基,观察3h后心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)的变化.采用甲苯胺兰(Toluidinblue)对核仁进行染色,光镜下观察核仁的结构变化,并采用电镜进一步观察核仁超微结构的改变.心肌细胞经42℃,30min热休克预处理(HSR)并恢复6h后,采用Westernblot及免疫组织化学方法观察HSP70在心肌细胞中的表达及应激状态下的分布变化.并观察HSR对H2O2所致LDH释放率及核仁结构变化的影响.经脂质体导入HSP70反义寡核苷酸以阻断HSP70的表达,观察其对热休克预处理保护作用的影响.结果0.5mmol/LH2O2引起心肌细胞LDH释放率明显升高(57.55%±3.18%vsCtrl8.93%±0.38%,P＜0.01),光镜下核仁染色颗粒数增多,电镜下核仁结构松散、核仁组份分离、碎裂.热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O2所致心肌细胞LDH释放率明显降低(21.68%±2.68%vsH2O257.55%±3.18%,P＜0.01)、核仁损伤明显减轻.免疫组化结果显示H2O2可引起HSP70从胞浆到胞核,再到核仁的移位.HSP70反义寡核苷酸的导入明显阻断了热休克预处理时HSP70的表达,并明显阻断了其对心肌细胞LDH释放率(43.70%±3.24%vsHSR±H2O221.68%±2.68%,H2O257.55%±3.18%,P＜0.01)及核仁损伤的保护作用.讨论H2O2可能通过引起蛋白质变性和聚集以及影响RNA聚合酶活性、rDNA模板活性,或者通过激活caspase-3系统,进而激活某些DNA或RNA核酸内切酶,从而导致核仁结构受损.应激时HSP70进入核仁以后,可能通过发挥其分子伴娘功能,与H2O2所致变性或聚集的RNA聚合酶、核糖核蛋白等结合,促使其复性或解聚,从而保证正常的细胞转录功能,维持核仁的正常结构;HSP70还可能在细胞浆内直接或间接抑制caspase-3的活化,或在核仁中与活化的caspase-3或其下游活化物结合而阻止caspase-3系统对核仁的损伤作用.上述结果提示H2O2可导致心肌细胞核仁结构损伤,HSP70表达及其向核仁的移位对上述损伤具有明显保护作用.     

缝隙连接蛋白26和30在大鼠2型糖尿病性耳聋模型中的表达

目的 探讨缝隙连接蛋白(Cx) 26和Cx30在大鼠2型糖尿病耳蜗中的表达,及两者在2型糖尿病性耳聋发病机制中的作用.方法 60只Wistar大鼠随机分为实验组(40只)和对照组(20只);实验组以腹腔注射10 mg/L链脲佐菌素建立2型糖尿病模型,检测模型成功前及成功后第1、2、3、4、5月的听性脑干反应(ABR),...     

肾上腺素受体对心肌细胞延迟整流钾电流的调控

心肌细胞上延迟整流钾电流(Ik)的门控动力学主要受膜电压的控制,同时也可被细胞膜肾上腺素受体及细胞内信号转导系统调节.当α1受体激动时,经G-蛋白介导在细胞内生产三磷酸肌醇和甘油二脂,后者可进一步作用于钙依赖的蛋白激酶(PKC),使通道蛋白磷酸化,调节Ik通道;β受体激动时,可经偶联G-蛋白导致细胞内cAMP增多,从而激活cAMP依赖的蛋白激酶(PKA),调节Ik通道.此调节作用将介导心肌细胞的生理和病理过程.     

肾上腺素受体信号转导通路对心功能的调节及机制

G蛋白偶联受体在心肌生长和收缩功能的调节中起重要作用 ,肾上腺素受体自身又被一系列特异性激酶所调控 ,这类激酶称为G蛋白偶联受体激酶。随着转基因鼠模型的发展和建立 ,对调控心血管系统的肾上腺素受体信号转导系统有了进一步认识。     

低氧无血清对乳鼠心肌细胞皮肤桥蛋白表达的影响

 目的 在体外用低氧无血清条件模拟缺血心肌微环境,探讨心肌细胞皮肤桥蛋白(DPT)表达的变化。方法 以低氧无血清处理乳鼠心肌细胞0 、6 、12 和24 h,用实时反转录聚合酶链式反应检测DPT mRNA的表达变化,用Western blot检测DPT的蛋白表达变化。用酶联免疫吸附实验（ELISA）证实低氧无血清处理乳鼠心肌细胞24 h DPT蛋白的表达变化。结果 与0 h组相比,低氧无血清处理心肌细胞6 、12 、24 h DPT的mRNA和蛋白水平均显著升高（p<0.05）。ELISA的方法也检测到低氧无血清处理心肌细胞24 h DPT的表达水平高于正常对照组（p<0.05）。结论 低氧无血清可促进乳鼠心肌细胞DPT的表达,DPT可能在缺血缺氧引起的心室重构中发挥一定的作用。     

桉叶油联合维甲酸对SD胎鼠脑组织Pax3和缝隙连接蛋白43表达的影响

目的探讨桉叶油联合维甲酸(RA)对SD胎鼠脑组织转录因子Pax3、缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法 SD孕鼠42只,随机分为6组,每组7只,正常对照组,RA组,溶剂对照组(花生油+RA),3个实验组(桉叶油高、中、低剂量+RA)。正常对照组自由摄食饮水,溶剂对照组于孕第7~14天每只花生油2ml灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。桉叶油3个剂量组于孕第7~14天分别桉叶油300、200和100mg/kg灌胃,每天1次,孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。RA组于孕第10天40mg/kg RA灌胃1次。各组于孕21天处死孕鼠取胚胎,Western blotting、免疫组织化学技术检测胎鼠脑组织的Pax3、Cx43蛋白的表达。Real-time PCR检测脑组织Pax3、Cx43 mRNA表达。阿利新蓝和茜素红进行骨骼染色,体视显微镜下观测椎骨发育,脊柱间隙。结果维甲酸灌胃各组胎鼠椎骨数量异常的胎鼠数与正常对照组比较差异无显著性,但在维甲酸灌胃各组中,胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率最低值分别为55%(桉叶油高剂量+RA组)和45.8%(桉叶油低剂量+RA组),较正常对照组高(0)(P0.05)。在维甲酸灌胃各组中,桉叶油各组胎鼠椎骨形态异常的异常率和胎鼠椎骨分裂的百分率最高值分别为62.5%(桉叶油低剂量+RA组)和55.0%(桉叶油高剂量+RA组),较维甲酸组(73.7%,73.7%)和溶剂对照组低(68.2%,63.6%,P0.05)。与正常组胎鼠比较,维甲酸灌胃各组大脑组织的Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较正常组高(P0.05),在维甲酸灌胃各组中,桉叶油灌胃各组胎鼠脑组织Pax3、Cx43蛋白及其mRNA的表达较单纯RA灌胃组低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论桉叶油对维甲酸引起胎鼠神经管缺陷有一定的拮抗作用。其机制可能与桉叶油拮抗维甲酸上调胎鼠神经组织的Pax3、Cx43蛋白过度表达有关     

甘氨酸受体在大鼠心肌细胞的表达

目的：检测成年大鼠心肌组织和新生大鼠心 肌细胞是否有甘氨酸受体（GlyR）mRNA和蛋白的表达。方法：选用成年 雄性SD大鼠心肌组织和新生SD大鼠培养心肌细胞，提取总RNA和膜蛋白，用逆转录－巢式聚 合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）检测GlyRα1和β亚基的mRNA 和蛋白表达。结果：成年大鼠心肌组织和新生大鼠培养心肌细胞均有与 脊髓组织GlyRβ亚基极为相似的mRNA和蛋白的表达；对于GlyRα1亚基，仅在新生SD大鼠培 养心肌细胞发现有mRNA的表达。结论：本研究证实在成年大鼠心肌组织 和新生大鼠心肌细胞中有与脊髓组织相似的GlyR亚基的表达，提示大鼠心肌细胞的膜上有Gl yR的存在。     

视黄醇结合蛋白1通过激活TAK1促进大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大

目的：探究视黄醇结合蛋白1(retinol binding protein 1, Rbp1)在大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大中的功能和机制。方法：本研究通过联合分析基因表达数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中的小鼠心肌肥厚基因芯片数据,寻找在心肌肥厚发生过程中的关键调控因子,构建该基因过表达及敲减腺病毒并感染大鼠乳鼠原代心肌细胞,利用血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大模型,研究目的基因对大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的影响,应用Western blot及RT-qPCR探究目的基因调控大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的分子机制。结果：在小鼠心肌肥厚心脏组织中Rbp1的表达显著上调（P<0.01）,体外细胞实验显示与对照组相比,Rbp1过表达组的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积显著增大,心肌肥厚标志基因心钠肽（atrial natriuretic peptide, Anp）和肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7, Myh7)的表达显著升高（P<0.01）,证实Rbp1过表达能促进Ang II诱导的大...     

抑制小鼠HL-1心肌细胞桥粒斑蛋白基因表达对缝隙连接蛋白43结构和功能的影响

 目的：采用基因沉默技术抑制小鼠HL-1心肌细胞桥粒斑蛋白（DSP）基因表达以明确DSP与缝隙连接蛋白43(Cx43)的结构和功能关系。方法：用基因沉默技术抑制DSP基因的表达,Western blotting和流式细胞术检测HL-1细胞DSP和Cx43蛋白的表达,用双免疫荧光方法检测DSP与Cx43蛋白的表达与定位情况,并用划痕标记染料示踪技术检测细胞缝隙连接通讯状况。结果：与空白组和对照组相比,siRNA-DSP组的DSP和Cx43蛋白表达量降低（P＜0.05）。免疫荧光检测发现空白组和对照组DSP与Cx43蛋白存在共定位情况,而siRNA-DSP组DSP和Cx43蛋白共定位遭到破坏,Cx43蛋白出现再分布,在细胞内检测到Cx43蛋白,并且划痕标记染料示踪技术检测发现siRNA-DSP组Lucifer yellow通过HL-1细胞缝隙连接的传输功能降低。结论：DSP表达抑制不仅使Cx43出现再分布,而且影响缝隙连接传导功能。     

β-肾上腺素能受体介导的心肌细胞凋亡

作为交感神经系统主要递质的去甲肾上腺素在多种心脏疾病中诱导心肌细胞凋亡 ,这种诱导作用主要由肾上腺素能受体 (β AR)介导 ,β AR还介导心肌细胞凋亡的信号转导 ,这对于了解心脏疾病的发病机理有一定的临床意义     

生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征

目的 观察生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征,建立理想的分离和纯化乳鼠心肌细胞技术. 方法 采用胰蛋白酶消化和机械分离,结合两次差速贴壁法以及使用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),从生后1～7d乳鼠心脏分离和纯化心肌细胞.观察细胞的形态和自发性搏动,并用心肌特异性肌钙蛋白丁(cTnT)免疫细胞化学染色进行鉴定.利用原位透射电镜术观察细胞超微结构,并观察其对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应. 结果 从乳鼠心脏分离的细胞95%以上为心肌细胞,存活率为95%以上.乳鼠心肌细胞包括短柱状或杆状细胞和不规则形细胞.生后1～3d鼠大部分杆状细胞呈现幼稚心肌细胞的超微结构特征.6～7d鼠的杆状细胞具有类似于成熟心肌细胞的超微结构特征,cTnT呈高表达,横纹明显.不规则形细胞含有少量肌丝束,排列不规则.少数体积较小的细胞呈现未分化细胞的超微结构特征.培养72h后80%以上的细胞出现自发性搏动.肾上腺素和异丙肾上腺素刺激后,搏动细胞数目增多,搏动增强.生后6～7d鼠杆状细胞的药物反应较强. 结论 两类心肌细胞的超微结构特征、自发性搏动和对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应不同.生后6～7d鼠心肌细胞较适合于成熟心肌细胞的体外实验研究.本实验建立的方法 是一种较理想的乳鼠心肌细胞培养方法 .     

丙泊酚对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏的影响

目的观察丙泊酚单次静脉给药对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏的影响,探讨丙泊酚循环抑制机制。方法选择拟全麻下行择期手术治疗的老年患者30例,随机分为3组（n=10）。低剂量组（L组）：丙泊酚1．0mg／kg,高剂量组（H组）：丙泊酚2．0mg／kg,对照组（c组）：生理盐水。全麻诱导前,静脉单次注药。给药前后3min,记录SBP、DBP和HR变化,同时抽取外周静脉抗凝血各15mL,Boyum法分离淋巴细胞,免疫印迹法分别检测总蛋白、胞膜和胞浆蛋白中的β1肾上腺素能受体表达,放免法检测异丙肾上腺素刺激的淋巴细胞内cAMP含量。结果与c组比较,L组和H组给药后均可引起SBP、DBP、淋巴细胞内cAMP含量及胞膜B1肾上腺素能受体蛋白水平降低（P〈0．05或P〈0．01）,胞浆B1肾上腺素能受体蛋白水平增加（P〈0．05或P〈0．01）;与L组比较,H组的指标变化明显（P〈0．05）。组间两两比较,淋巴细胞总蛋白中β1肾上腺素能受体水平变化均无显著差别（P〉0．05）。结论丙泊酚单次静脉给药可引起老年患者外周血淋巴细胞B1肾上腺素能受体脱敏,且呈剂量依赖性,与促进β1肾上腺素能受体由胞膜内化进入胞浆有关;β1肾上腺素能受体脱敏可能是丙泊酚的循环抑制机制之一。     

甘氨酸受体α_1亚基在乳鼠心肌细胞的表达及损害性因素对其表达的影响

目的:研究甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)在乳鼠心肌细胞中的表达以及脂多糖(LPS)、缺氧/复氧(H/R)、异丙肾上腺素(ISO)和高糖(HG)对其表达的影响。方法:体外培养乳鼠心肌细胞,Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达;心肌细胞分别用LPS、H/R、ISO以及HG处理24 h,采用CCK-8试剂检测细胞活力,Western blotting方法检测心肌细胞上GlyRα1的表达。结果:Western blotting方法检测到乳鼠心肌细胞上GlyRα1的表达;LPS(20 mg/L)、ISO(100μmol/L)以及HG(25mmol/L)处理心肌细胞24 h与心肌细胞H/R 3 h对心肌细胞存活率无明显影响;LPS组、H/R 3 h组以及ISO组心肌细胞上GlyRα1表达均高于对照组(P0.01),而HG组心肌细胞上GlyRα1表达低于对照组(P0.01)。结论:乳鼠心肌细胞上存在GlyRα1,并且一定浓度的LPS、ISO与一定时间的H/R均可上调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达,而HG可下调乳鼠心肌细胞GlyRα1的表达。