颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。     

MafA基因真核表达质粒的构建及其在人肝癌细胞HePG-2中的表达和作用

目的构建胰岛素启动子肌腱膜的纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)基因的真核表达质粒,并观察MafA基因在人肝癌细胞HePG-2中的表达及其作用,为糖尿病基因治疗的研究奠定基础。方法提取小鼠胰腺组织总RNA,经RT-PCR扩增MafA基因片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N2和pEGFP-C1中。用脂质体将重组表达质粒转染至人肝癌细胞HePG-2中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测转染细胞中MafA和insulinⅡ基因的转录水平,Western blot检测融合蛋白EGFP-MafA的表达。结果重组表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA经PCR、双酶切和测序证明构建正确;重组质粒转染的HePG-2细胞有绿色荧光蛋白表达;经RT-PCR可检测到MafA基因表达,但未检测到insulinⅡ基因表达;经Westernblot检测,在相对分子质量约70 000处可见特异性反应条带。结论已成功构建了MafA基因真核表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,以其转染的HePG-2细胞可表达MafA基因,并翻译成蛋白,但未表达insulinⅡ基因。     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

RI基因siRNA干扰质粒的构建及其对人膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的构建核糖核酸酶抑制因子(RI)基因siRNA干扰质粒,并检测其对人膀胱癌细胞BIU-87迁移和侵袭能力的影响。方法设计并构建针对RI基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体和1个无同源性的阴性对照载体,经酶切和DNA测序鉴定后,转染BIU-87细胞,通过RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测干扰的有效性。光镜及HE染色观察细胞形态的改变,黏附试验、划痕试验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构。结果酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性siRNA表达载体的BIU-87细胞RI蛋白的表达水平明显降低,对照组未发生明显改变;转染干扰质粒的细胞堆叠严重,细胞黏附能力显著降低,迁移和侵袭能力显著提高,细胞骨架微丝聚集,伸展出片状伪足。结论已成功构建RI基因siRNA干扰质粒,其可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,说明RI可作为抑制肿瘤迁移和侵袭的有效靶点。     

趋化因子CXCL12受体CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U87增殖及血管内皮生长因子、白细胞介素-8表达的影响

目的探讨趋化因子CXCL12受体CXCR4 sh RNA对胶质瘤细胞U87增殖及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)表达的影响,为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。方法用脂质体Lipofectimine TM 2000分别将CXCR4 sh RNA载体p GPU6/GFP/Rac1-421和非特异质粒p GPU6/GFP/NC转染U87细胞,并设未转染组,转染后48 h,采用RT-PCR法检测各组细胞中CXCR4基因m RNA的转录水平;转染后24、48、72 h,采用MTT法检测细胞的增殖活力,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF和IL-8的含量。结果转染p GPU6/GFP/Rac1-421可使U87细胞中CXCR4基因m RNA的转录水平、细胞体外增殖活力及细胞培养上清中VEGF和IL-8的含量均明显降低,与p GPU6/GFP/NC组和未转染组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论 CXCR4 sh RNA可下调U87细胞中CXCR4基因m RNA的转录,抑制细胞增殖,降低VEGF和IL-8的产生,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用。     

Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达

目的构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。     

Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

目的构建由Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子,替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的pEGFP-C1真核表达质粒pEGFP-C1/Surp,转染A549细胞及人胚肺成纤维细胞MRC-5,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果重组表达质粒pEGFP-C1/Surp经双酶切和测序鉴定,证明构建正确。转染A549细胞和MRC-5细胞后,在荧光显微镜下可见A549细胞有较强的绿色荧光,而MRC-5细胞则未见绿色荧光。结论已成功构建以Survivin启动子为调控序列、EGFP为标示蛋白的真核表达质粒,且具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤靶向性基因治疗载体奠定了基础。     

基于口蹄疫病毒2A片段的多基因共表达质粒的构建及表达

目的构建基于口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)2A片段的多基因共表达质粒,并在293T细胞中共表达HBx、人Sox2及人c-Myc基因。方法以FMDV 2A自剪切片段连接HBx、Sox2和c-Myc基因编码序列,克隆至载体pEGFP-C1,构建多基因共表达质粒pEGFP-XSM;在脂质体LipofectamineTM2000的介导下,将重组质粒pEGFP-XSM转染293T细胞,同时设空载体组(转染空载体pEGFP-C1)和空白对照组(未转染),转染48 h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达;Real-time PCR和Western blot法分别检测各组293T细胞中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果多基因共表达质粒pEGFP-XSM经酶切和测序鉴定构建正确;空载体组和pEGFP-XSM转染组细胞荧光镜下均可见GFP的表达;pEGFP-XSM转染组中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平较空白对照组及空载体组均明显升高(P﹤0.001);pEGFP-XSM转染组可见相对分子质量约48 000的GFP-HBx-2A融合蛋白条带和约38 000的HA-Sox2-2A融合蛋白条带,各组均可见相对分子质量约49 000的c-Myc蛋白条带,pEGFP-XSM转染组c-Myc蛋白的表达水平明显高于空白对照组及空载体组(P﹤0.01)。结论成功构建了多基因共表达质粒pEGFP-XSM,并在293T细胞中实现了HBx、Sox2和c-Myc蛋白的共表达,为进一步深入研究该共表达蛋白在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展中的生物学机制奠定了基础。     

腺病毒5型E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响

目的探讨E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响。方法双酶切质粒pUC119-E1A,获得E1A基因,连接入pEGFP-C1载体,构建真核表达质粒pEGFP-E1A。经脂质体介导转染人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株,经筛选获得稳定表达E1A基因的转染细胞。RT-PCR检测E1A基因的mRNA转录水平。体外观察各组细胞软琼脂集落及对抗肿瘤药物顺铂的敏感性。结果RT-PCR结果显示,只有重组质粒pEGFP-E1A转染的细胞在约380 bp处有一特异性扩增条带,与未转染组和空载体转染组相比,转染E1A基因后,SK-BR-3肿瘤细胞在软琼脂中形成的集落明显变小,集落形成率明显降低,对顺铂的敏感性明显提高。结论已成功构建E1A基因表达质粒,并稳定表达了E1A基因,表达产物明显抑制乳腺癌细胞的生长,有效提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为其临床应用提供了理论和实验依据。     

人骨形态发生蛋白-7在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达

目的探讨人骨肉瘤细胞U2-OS表达重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-7,rhBMP-7)的可行性。方法将hBMP-7成熟肽基因片段克隆至载体pcDNA3.1上,构建真核表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7。利用Lipofectamine 2000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达。结果真核组表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7经NdeⅠ和EcoRⅤ双酶切及测序鉴定证明构建正确。pcDNA3.1-rhBMP-7质粒转染的U2-OS细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达水平均明显高于pcDNA3.1载体转染的细胞(P0.05)。结论成功构建了hBMP-7基因的重组表达质粒,并在U2-OS细胞中成功表达,为进一步研究hBMP-7的制备方法和建立新的表达系统奠定了基础。     

肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建肿瘤抑制基因WWOX的真核表达载体,并观察其在人肺腺癌细胞A549中的表达。方法采用RT-PCR法,从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因,将其克隆至pMD18-T载体上,测序后定向连接到真核表达载体pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-WWOX,并用脂质体转染至A549细胞中,采用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)与WWOX的融合蛋白在A549细胞中的表达。结果测序结果显示,RT-PCR法获得的WWOX全编码序列与GenBank中报道的序列一致。真核表达载体pEGFP-C1-WWOX转染A549细胞48h后,共聚焦显微镜观察到细胞中有绿色荧光呈现,RT-PCR观察到WWOX基因得到有效转录。结论已成功构建了肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体pEGFP-C1-WWOX,并在A549细胞中表达了WWOX和GFP融合蛋白。     

hepaCAM基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建表达肝细胞黏附分子(Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因的重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法以质粒pEGFP-N2-hepaCAM为模板,PCR扩增hepaCAM基因,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-hepaCAM经PmeⅠ线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM经PmeⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒AdI-hepaCAM,经大量扩增后,检测病毒滴度。RT-qPCR及Westernblot检测感染的BIU-87细胞内hepaCAM的表达。结果酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM构建正确,重组腺病毒AdI-hepaCAM滴度可达1.6×1012pfu/ml,与空载体腺病毒组比较,经重组腺病毒感染的BIU-87细胞中hepaCAM mRNA及蛋白的表达均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带hepaCAM的重组腺病毒载体AdI-hepaCAM,为研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞增殖的调控提供依据。     

人源阳离子抗菌肽hCAP-18真核表达载体的构建与表达

目的构建人源性阳离子抗菌肽hCAP-18的真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,转染真核细胞,并检测其表达。方法以正常人外周血中性粒细胞的总RNA为模板,用RT-PCR技术钓取hCAP-18编码序列的全长cDNA,并克隆至pcDNA4/Myc-His真核表达载体上,转染真核细胞株HeLa。RT-PCR及Western blot方法检测目的基因的表达。结果所构建的真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,经酶切鉴定所释放片段大小与预期相符,基因序列与GenBank上登录的序列一致,目的基因在转染细胞中获得高水平表达。结论已成功构建真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,并在转染细胞中高效表达。     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中的表达

目的在BHK细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ST6Gal1,并转染BHK细胞,免疫荧光法检测α-2,6唾液酸转移酶的表达。结果克隆的α-2,6唾液酸转移酶基因与GenBank中报道的已知序列完全一致,重组真核表达质粒转染的BHK细胞表面SAα2,6Gal含量增加。结论α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中获得了有效表达,为流感病毒受体的研究提供了技术支持。     

PLCε基因shRNA重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标签的表达PLCε基因shRNA的重组腺病毒质粒Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究膀胱癌的基因治疗奠定基础。方法将干扰质粒pGenesil-PLCε及阴性对照质粒pGenesil-NP的表达启动子U6及shRNA序列克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的穿梭质粒pAdTrack,经酶切及测序鉴定正确后,将重组穿梭质粒经PmeI线性化,转化感受态AdEasier。重组pAdEasy-U6-PLCε质粒经PacI线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-PLCε,经大量扩增后测定病毒滴度,RT-PCR及Western blot检测T24细胞内PLCε的表达情况。结果酶切及测序鉴定证实pAdTrack-U6-PLCε及重组pAdEasy-U6-PLCε质粒构建正确,并成功转染至HEK-293细胞,重组腺病毒Ad-U6-PLCε滴度达1.5×1012,经重组腺病毒感染的T24细胞内PLCεmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论已成功构建针对PLCε基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究PLCε对膀胱癌发生发展的作用奠定了基础。