培养Schwann细胞用于构建毛囊神经嵴干细胞定向分化饲养层

目的培养原代Schwann细胞,用于构建毛囊神经嵴干细胞饲养层构建。探索Schwann细胞（Schwanncells）对胎牛血清浓度的依耐性;检测Schwann细胞在不同血清浓度下的活性及分泌状态,并应用此饲养层定向诱导毛囊神经嵴干细胞分化。方法原代培养及纯化Schwann细胞;用不同血清浓度的胎牛血清（FBS）培养基培养Schwann细胞,测定并用四氮唑盐（MTT）比色法检测Schwann细胞生长及增殖情况;使用$100特异性标识抗体间接免疫荧光法与荧光染料Hoechst33342对Schwann细胞进行鉴定。用ELISA方法检测Schwann细胞的分泌因子。利用丝裂霉素C处理Schwann细胞建立饲养层,培养Schwann细胞和毛囊神经嵴干细胞。结果体外成功培养Schwann细胞,用S100间接免疫荧光法与核染料Hoechst33342鉴定Schwann细胞呈阳性表达,纯度约95％,成功培养毛囊神经嵴干细胞。无血清的培养基可使Schwann细胞生长状态良好。饲养层细胞能够稳定分泌神经生长因子（nerve growth factor,NGF）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）,可诱导毛囊神经嵴干细胞定向分化。结论无血清的培养基更利于毛囊神经嵴干细胞饲养层的构建。饲养层Schwann细胞可持续分泌NGF和BDNF等神经营养因子,可成为使毛囊神经嵴干细胞定向分化的稳定饲养层细胞。     

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

 目的 为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hESc)体外培养系统，本实验欲用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts, hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法 利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞，纯化增殖细胞，采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc（HS181细胞株）接种在该饲养层上，连续传代至20代，倒置显微镜观察其形态学变化，测定其细胞碱性磷酸酶活性，类胚体形成实验及干细胞转录因子表达，严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice, SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。 结果 hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛，连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖，24h内能较好地保持细胞活力和形态学特征，具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代任能较好地保持未分化状态，细胞呈克隆性生长，高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子；悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体（Embryoid bodies, EB）结构, 可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达，证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞，说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示：将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论 hPFF可作为一种来源丰富，取材方便的人源化饲养层细胞，能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险，初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。     

骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞

目的:探讨以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的方法.方法:以鼠间充质干细胞作为饲养层,收集受孕3.5～4 d昆明小鼠的囊胚和桑椹胚进行培养,筛选纯化细胞集落,使其稳定传代后,采用光镜,碱性磷酸酶染色及Oct-4染色对其形态学和生物学性状进行初步鉴定.结果:以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养的昆明小鼠ES有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测,末分化的Es细胞显微镜下为黄褐色,分化的不着色;Oct-4染色阳性.结论:以间充质下细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞可行,得到的胚胎干细胞能保持特殊的形态和未分化状态.     

血管内皮细胞作为饲养层细胞对胚胎干细胞的生长支持作用

目的:探讨人脐静脉血管内皮细胞是否可作为饲养层来支持胚胎干细胞的生长,并维持其未分化状态.方法:使用健康产妇剖宫产后遗弃的脐带培养内皮细胞,并进行细胞传代培养和增殖扩增.将脱离饲养层克隆生长良好的E14.1胚胎干细胞接种到经丝裂霉索C(10 mg/L)灭活后的2～5代内皮细胞饲养层上进行传代培养,对培养的胚胎干细胞进行碱性磷酸酶、Oct-4及体内全能分化实验鉴定.结果:E14.1胚胎干细胞在人脐静脉内皮细胞上传3～8代后能较好地保持未分化状态,高度表达碱性磷酸酶及干细胞因子Oct-4;体内全能分化实验显示,在内皮细胞上生长6代和10代以上的E14.1胚胎干细胞被接种到裸鼠6周后,形成含三个胚层的组织细胞畸胎瘤.结论:(1)人脐静脉血管内皮细胞可作为饲养层支持胚胎干细胞的生长;(2)胚胎干细胞在内皮细胞上能保持未分化状态;(3)人脐静脉血管内皮细胞可以作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞新来源,为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

精原干细胞体外非分化扩增的初步研究

目的探讨精原干细胞体外非分化性扩增的影响因素。方法采用昆明系小白鼠骨髓基质细胞原代培养,待细胞长成单层后经丝裂霉素C处理,作为精原干细胞培养的饲养层,细胞在37℃环境下培养。结果接种后2～4d,精原干细胞数明显增加,细胞单个、成双或成群,非精原干细胞开始出现崩解死亡;接种4～8d,精原干细胞增殖不明显,处于相对静止期;接种10d后,又开始出现明显的分裂增殖,15d已具有精原干细胞特征,继续培养25d,细胞形态未见明显改变,胞质桥仍明显。结论精原干细胞能在37℃环境温度下,在以骨髓基质饲养层上保持良好非分化性扩增。     

探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件

【目的】探讨保持胚胎干细胞 (EScells)全能性的体外培养条件。【方法】将ES D3细胞株培养在SNL饲养层细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上以及在无饲养层的条件下 ,培养基中加入小鼠白血病抑制因子 (mLIF)或用BuffaloRatLiver(BRL)条件培养基进行培养 ,并对培养细胞进行碱性磷酸酶检测和染色体分析。【结果】ES D3在上述培养体系中能形成正常形态的克隆 ,并且经多次传代后碱性磷酸酶检测为阳性 ,而且核型保持稳定。【结论】说明上述各种培养体系均能保持ES D3的高度未分化状态及正常的二倍体核型。     

大鼠胎肝前体细胞的分离培养

目的：探索胚龄(ED)13．5d大鼠胚胎肝脏中肝前体细胞的生物学特性，为细胞移植及基因导向治疗奠定基础。方法：酶消化法分离肝前体细胞，观察不同体外培养对肝前体细胞生物学功能的影响，并用免疫组化方法鉴定分离培养细胞的分化标志。结果：肝前体细胞在原代胚胎成纤维细胞饲养层(PREF)培养，其增殖能力较无饲养层培养强，原代培养可保持未分化状态。细胞分化标志鉴定提示EDl3．5d大鼠胚肝前体细胞中存在双分化能力的细胞。结论：EDl3．5d大鼠胚肝前体细胞存在双分化能力的原始肝细胞，肝前体细胞可在PREF进行体外扩增。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

利用细胞饲养层分离培养大鼠胚胎干细胞

目的 从大鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞.方法收集大鼠的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,5～6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态、分化过程及细胞核型的检测.结果细胞集落性生长,符合胚胎干细胞的特征.结论大鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期培养

目的建立体外研究精原干细胞与支持细胞共培养的细胞模型,研究体外精原干细胞在支持细胞层上的增殖特点。方法应用两步酶消化法,分别从14～15d及6d龄雄性昆明小鼠睾丸中分离支持细胞及精原干细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。将精原干细胞接种在支持细胞层上,观察不同时间点精原干细胞集落形态及数目。结果在支持细胞层上培养24h后,精原干细胞开始增殖分裂,呈双细胞形态;随着培养时间延长,双细胞集落数逐渐减少,而链状细胞集落逐渐增加;培养120h后,链状细胞局部融汇堆积,且细胞集落维持在相对稳定数量。在每4～5d更换培养液的条件下,细胞集落维持稳定状态的平均时间为(51,2±5.8)d。结论精原干细胞在体外支持细胞层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可用于体外研究生精细胞增殖分化特征、药物或毒物干扰精原干细胞功能实验。     

单细胞克隆小鼠胚胎干细胞系的建立

目的:建立胚胎干细胞的培养系统及培养方法.方法:用免疫溶解法(immunosurgery)分离3.5 d的129SvJ系小鼠囊胚内细胞团,在γ射线照射的胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,胰酶消化传代.用组织化学法、免疫组织化学方法识别细胞表面标志,常规G带法行染色体核型分析,在体、离体分别观察细胞的多向分化能力.结果:得到一个单细胞克隆129系小鼠胚胎干细胞系G11能长期稳定增殖不分化,具有正常40XY核型,碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性,在体和离体条件下可分化为多种细胞.结论:以小鼠为模型成功建立了哺乳动物胚胎干细胞的培养方法和培养系统.     

兔胚胎干细胞的早期培养条件初步研究

目的探索小鼠胚胎内胚层细胞和鸡胚提取物（CEE）对兔胚胎干细胞早期培养的影响。方法用全新的方法对兔胚胎干细胞的建系条件进行探讨。将分离到的囊胚期内细胞团接种到丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎内胚层细胞饲养层和几种不同的培养液构成的培养体系中,观察内细胞团的贴壁和生长状况,并对由内细胞团生长出的具有胚胎干细胞形态的细胞集落进行传代。结果以灭活的小鼠胚胎内胚层细胞作为饲养层,以78％D-MEM／F-12＋20％Knockout SR＋2mmol／L L—Glutamine＋1％MEM NAA＋O．1mmol／L β-mercaptoethanol＋8ng／ml hrbFOF＋2％CEE做培养液,兔内细胞团可以很好的贴壁,生长成具有标准的胚胎干细胞（ESC）形态的细胞集落。结论小鼠内胚层细胞和CEE联合使用可以很好的支持原代兔胚胎干细胞（RESC）的生长,小鼠内胚层细胞和CEE中可能含有某些抑制RESC分化的因子。     

间充质干细胞及其培养上清与融冻产物对脐血CD34+ 细胞扩增及分化的作用

 【目的】 探讨人骨髓间充质干细胞(MSC)及其培养上清&#65380;融冻产物对脐血CD34+ 细胞扩增及分化的作用&#65377;【方法】 分离纯化人骨髓MSC,收集纯化三代的MSC培养上清,采用反复冻融法获得MSC融冻产物,采用免疫磁珠分选系统纯化脐血CD34+ 细胞&#65377;实验分为4组,分别为含MSC滋养层组&#65380;MSC上清组&#65380;MSC融冻产物组及单纯造血生长因子(HGFs)对照组&#65377;流式细胞仪检测人脐血CD34+ 细胞在这四种培养体系中第6天和第12天有核细胞数及CD34+&#65380;CD34+CD38-&#65380;CD41+&#65380;CD19+&#65380;CD3+ 细胞含量&#65377; 【结果】 ①MSC滋养层组对脐血有核细胞和对脐血CD34+&#65380;CD34+ CD38- 的扩增能力最强,MSC培养上清组和MSC滋养层相比具有类似的作用,但其作用强度减弱(P < 0.05)&#65377;②MSC培养上清和MSC均具有抑制脐血CD34+ 细胞分化为CD3+ 和CD19+ 细胞的作用,差异无显著性(P > 0.05)&#65377;③MSC培养上清和MSC均具有促进脐血CD34+ 细胞向CD41+ 细胞分化的作用,MSC滋养层的作用强于MSC培养上清(P < 0.05)&#65377;④MSC融冻产物已完全丧失对脐血CD34+ 细胞扩增和分化作用,与单纯因子对照组相似(P > 0.05)&#65377;【结论】 MSC培养上清对脐血CD34+&#65380;CD34+ CD38- 细胞均具有扩增作用,而且可促进脐血CD34+ 细胞向CD41+ 细胞分化&#65377;     

人胚胎干细胞体外培养及特性分析

目的探讨人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的体外培养及其特性。方法 hESCs接种于饲养层细胞,培养液为含20%Knockout SR的Knockout DMEM,其中添加10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过观察细胞形态、免疫细胞化学技术分析hESCs表面标志分子SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1和TRA-1-60的表达,鉴定hESCs的未分化状态;G显带技术分析细胞染色体核型。同时,通过分析hESCs体外形成胚胎体、体内生成畸胎瘤的情况,鉴定hESCs的分化潜能。结果 hESCs在饲养层细胞上呈克隆生长,细胞为二倍体核型。hESCs表达SSEA-3、SSEA-4、以及TRA-1-60细胞表面特征性标志。体内、外分化实验证实hESCs具备多分化潜能。结论 hESCs在体外培养条件下能够保持未分化状态和发育的全能性,为进一步探索hESCs的诱导分化,以及hESCs的应用研究提供可行性保证。