乳香胶联合吉西他滨对人胰腺癌BxPc-3细胞的作用及机制初探

目的 研究乳香胶联合吉西他滨对体内、外培养的人胰腺癌BxPc-3细胞的作用及相关机制.方法 四唑氮蓝还原法检测BxPc-3细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡(PI单染色法).Western blot检测不同浓度的乳香胶联合吉西他滨(两药联合组)用药后BxPc-3细胞内测核转录因子-κB(NF-κB) p65亚基以及NF-κB抑制蛋白IkB、凋亡调节蛋白Bcl 2和Bax的表达水平的变化.建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,监测移植瘤体积变化.结果 两药联合组选择乳香胶(40 mg/L)和吉西他滨(10 mg/L)处理72 h后,抑制人胰腺癌细胞株BxPc-3细胞的作用显著优于单独使用(P＜0.01);凋亡比例(45.13±4.01)明显高于乳香胶组或吉西他滨组(P＜0.01)和对照组(5.07±1.37,P＜0.01);乳香胶或两药联合可抑制NF-κB的活性;对人胰腺癌BxPc-3细胞作用48 h后,Bcl-2的蛋白表达明显低于吉西他滨组和对照组(P＜0.01).而IkB和Bax蛋白的表达显著高于吉西他滨组和对照组(P＜0.01).与对照组比较,乳香胶或两药联合组可显著抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生长(P＜0.05).结论 乳香胶可通过抑制NF-κB的活性,增加IkB和Bax蛋白表达、抑制Bcl-2的蛋白表达,发挥抗肿瘤作用,并增强吉西他滨的药效.     

Survivin反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡并增加吉西他滨的化疗敏感性

目的探讨凋亡抑制蛋白Survivin反义寡核苷酸转染对胰腺癌BxPC 3细胞系SurvivinmRNA的表达及细胞增殖、凋亡和对吉西他滨化疗敏感性的影响。方法用脂质体瞬时转染法介导Survivin反义硫代磷酸寡核苷酸处理胰腺癌BxPC 3细胞后用RT PCR检测SurvivinmRNA的表达 ,四唑氮蓝法检测细胞的相对存活率 ,用流式细胞仪和透射电镜检测其对BxPC 3细胞的凋亡诱导作用。结果Survivin反义寡核苷酸作用于BxPC 3细胞后 ,细胞的存活率呈剂量和时间依赖性 ,其中 2 4h的IC50 值为 4 0 0nmol/L ,在此浓度和时间下 ,Survivin反义寡核苷酸可明显降低SurvivinmR NA的表达 ,细胞凋亡率为 (2 5± 3) %。在透射电镜下BxPC 3细胞可呈凋亡的早期改变。Survivin反义寡核苷酸和吉西他滨的联合实验组与单独应用吉西他滨组相比 ,在 4 8h和 72h可使细胞的存活率分别降低 2 76和 4 5 8倍。结论Survivin反义寡核苷酸可诱导胰腺癌细胞凋亡、抑制细胞增殖并增强吉西他滨的化疗敏感性。     

Smac/DIABLO诱导胰腺癌细胞凋亡并增加对TRAIL及吉西他滨化疗的敏感性

目的 探讨外源性Smac/DIABLO对人胰腺癌SW1990细胞生物学特性和对TRAIL及吉西他滨化疗敏感性的影响. 方法 利用脂质体2000介导Smac/DIABLO基因转染胰腺癌SW1990细胞获得细胞SW1990/Smac,转染空载体为对照组(SW1990/neo);在不同浓度和时间下以肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和吉西他滨处理2组细胞株并分为TRAIL组、吉西他滨组和联合组.MTT法检测细胞株的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率及凋亡细胞形态,Western blot检测凋亡相关蛋白Smac/DIABLO、抑制凋亡蛋白XIAP、细胞色素C及细胞凋亡因子caspase-3的表达.结果 转染Smac/DIABLO的细胞生长明显落后于转染空载体的细胞.TRAIL浓度为200、500、1000、2500 ng/ml时,作用24 h对SW1990/neo和SW1990/Smac细胞的抑制率分别为11.11％、46.03％、67.08％、76.19％及22.11％、42.67％、56.63％、67.6％ (P ＜0.05).吉西他滨浓度分别为10、20、40、60μmol/L作用24 h对SW1990/neo和SW1990/Smac的抑制率分别为15.2％、34.6％、55.16％、76.4％和22.65％、36.85％、55.11％、79.99％ (P＜0.05).以TRAIL(500 ng/ml)、吉西他滨(20 μmol/L)及TRAIL(500 ng/ml)+吉西他滨(20 μmol/L)作用24 h后,SW1990/neo和SW1990/Smac细胞的凋亡率分别为5.64％、15.30％、27.27％和20.37％、23.27％、67.30％ (P ＜0.05).SW1990/Smac细胞在TRAIL及吉西他滨作用后,细胞内促凋亡蛋白Smac/DIABLO、细胞色素C及caspase-3活化片段表达均显著升高,而抑制凋亡蛋白XIAP表达显著降低(P＜0.05).结论 Smac/DIABLO可诱导SW1990细胞的凋亡、抑制细胞增殖,并增强胰腺癌细胞对TRAIL及吉西他滨的化疗敏感性,其机制可能与Smac/DIABLO、细胞色素C、XIAP及caspase-3的活性有关.     

VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨鸡贫血病毒VP3基因在人膀胱癌EJ细胞株中的表达,观察VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌EJ细胞株凋亡的效应。方法用真核表达载体PcDNA3-VP3转染人膀胱癌EJ细胞株,利用RT-PCR技术检测VP3基因在EJ细胞中的表达状况。观察VP3基因和10^-7mol／L、10^-8mol／L、10^-9mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的增殖活性的影响,检测VP3基因和10^-8mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的凋亡作用。结果转染PcDNA3-VP3后VP3基因在EJ细胞中表达。转染重组质粒PcDNA3-VP3、吉西他滨各浓度、VP3基因联合吉西他滨各浓度的EJ细胞株的增殖活性明显下降（P〈0．01）。透射电镜下观察到凋亡细胞的典型形态学特征。TUNAL法检测EJ细胞株凋亡率表现为：转染PcDNA3-VP3组高于对照组（P〈0．01）,10^-8mol／L浓度的吉西他滨组高于对照组（P〈0．01）,联合组高于转染PcDNA3-VP3组（P〈0．01）。结论VP3基因表达能高效诱导人膀胱癌EJ细胞株细胞凋亡,联合10^-8mol／L浓度的吉西他滨能增加VP3基因诱导的人膀胱癌EJ细胞株凋亡。     

靶向Survivin的siRNA联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖

目的 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体,观察其对吉西他滨化疗抑制胰腺癌Pane-1细胞增殖的影响.方法 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体psiRNA-Survivin,行酶切和测序鉴定.用重组质粒转染Pane-1细胞并筛选稳定转染的细胞株,绘制细胞生长曲线.采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测Survivin的mRNA和蛋白表达变化.以吉西他滨分别作用于对照组和转染组Panc-1细胞24 h,噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 酶切和测序鉴定表明,成功构建了psiRNA-Survivin重组质粒.重组质粒稳定转染胰腺癌细胞株后,Survivin的mRNA和蛋白表达分别下调了79.2%和83.6%(P<0.05),生长曲线明显变平缓,并能显著增强吉西他滨对Panc-1细胞的增殖抑制[(24.6±4.5)%/(38.7±5.2)%]和凋亡诱导作用[(16.7±2.5)%/(26.8±3.4)%,P<0.05).结论 构建Survivin的siRNA表达载体可明显下调Survivin的表达,抑制Panc-1细胞增殖,并能提高细胞对吉西他滨的化疗敏感性.     

5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷联合吉西他滨对胰腺癌细胞株原钙黏蛋白8基因表达的影响

目的 研究5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-CdR)对胰腺癌细胞株Capan-2原钙黏蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)基因DNA启动子甲基化的转录调控,以及联合吉西他滨对癌细胞生长抑制与凋亡的影响.方法 采用MTT法、流式细胞术检测5-Aza-CdR及联合吉西他滨对Capan-2细胞的抑制率与凋亡率.应用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR和Western blot的方法检测不同浓度5-Aza-CdR处理细胞前后PCDH8基因的甲基化状态、mRNA表达水平和蛋白表达水平.结果 5-Aza-CdR能使胰腺癌细胞Capan-2增长速度减慢,呈浓度依赖性,联合吉西他滨显著抑制细胞生长;5-Aza-CdR联合吉西他滨与单药组、对照组相比,可显著诱导细胞凋亡.不同浓度的5-Aza-CdR可逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞Capan-2的甲基化,恢复mRNA表达水平和蛋白表达水平,并呈一定的浓度正相关.结论 5-Aza-CdR可有效逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞株Capan-2的高甲基化状态,解除DNA高甲基化导致的基因沉默,重新诱导基因mRNA转录和蛋白表达,同时可抑制胰腺癌细胞生长,与吉西他滨有协同抗肿瘤作用.     

RNA干扰对膀胱癌T24细胞血管内皮生长因子C表达的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)抑制膀胱癌T24细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达和提高化疗敏感性.方法 根据转染效率最高时pEGFPN1质粒与脂质体的比例,转染T24细胞,实验分为3组,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF-C mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率.结果 转染后24 h,即有mRNA表达水平的下降,Quantity one半定量:24 h 0.57±0.17,48 h 0.42±0.11,72 h0.33±0.09.VEGF-C抑制后,吉西他滨诱导的凋亡率明显升高,转染组为(41.38±1.54)%,明显高于未转染组(22.87±1.40)%与脂质体组(23.47±1.58)%(P<0.05).结论 RNAi可高效稳定抑制膀胱癌T24细胞中VEGF-C的表达,明显提高吉西他滨诱导膀胱癌T24细胞凋亡的药物敏感性.     

白藜芦醇对人胰腺癌PANC-1细胞增殖与侵袭的影响

目的 探讨白藜芦醇对人胰腺癌PANC-1细胞增殖与侵袭能力的影响.方法 实验分为空白对照组,0.1%DMSO组,白藜芦醇组(50、100、200 μmol/L).MTT法检测白藜芦醇对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化;Transwell侵袭小室检测白藜芦醇对细胞侵袭的影响;荧光实时定量PCR和Western blot检测白藜芦醇对细胞Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达的影响.数据以-x±s表示,多组比较采用方差分析.结果 (1)空白对照组抑制率为0;0.1%DMSO组细胞抑制率为3.25%±0.42%;白藜芦醇50 μmol/L组细胞抑制率为13.23%±1.68%;白藜芦醇100μmol/L组细胞抑制率为42.25%±3.20%;白藜芦醇200μmol/L组细胞抑制率为56.94%±5.31%.各组比较,差异有统计学意义(F=460.10,P<0.05).(2)空白对照组细胞凋亡率为0.05%±0.03%;0.1%DMSO组细胞为凋亡率为3.39%±1.77%;白藜芦醇50 μmol/L组细胞凋亡率为6.92%±1.85%;白藜芦醇100 μmol/L组细胞凋亡率为19.05%±2.01%;白藜芦醇200 μmol/L组细胞凋亡率为27.17%±6.43%.各组比较,差异有统计学意义(F=38.84,P<0.05).(3)0.1%DMSO组对细胞周期无显著影响.白藜芦醇引起PANC-1细胞G0/G1期和S期阻滞,G2/M期细胞减少.(4)空白对照组平均穿膜细胞数为61±13;0.1%DMSO组为54±13;白藜芦醇50 μmol/L组为48±15;白藜芦醇100 μmol/L组为23±6;白藜芦醇200 μmol/L组为18±7.各组比较,差异有统计学意义(F=69.08,P<0.05).(5)白藜芦醇可使PANC-1细胞Bax表达升高,Bcl-2表达下调.MMP-2、MMP-9的表达明显受到抑制,mRNA和蛋白水平变化一致.结论 白藜芦醇可明显抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制其侵袭能力.     

二氢青蒿素联合吉西他宾治疗胰腺癌的实验研究

目的 探讨二氢青蒿素联合吉西他宾治疗胰腺癌的作用及其机制.方法 培养胰腺癌细胞株BxPC-3和Panc-1,通过MTT法检测二氢青蒿素联合吉西他宾对胰腺癌细胞生长的抑制作用;通过Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡情况;通过EMSA检测NF-κB与DNA结合活性的改变;通过Western blot法检测细胞中NF-κB/P65和NF-κB下游增殖、凋亡相关蛋白的表达情况.裸鼠皮下注射BxPC-3细胞建立胰腺癌裸鼠移植瘤,监测给药后肿瘤体积的变化,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 二氢青蒿素联合吉西他宾对BxPC-3和Panc-1两株细胞的增殖抑制率可达(81.1±3.9)%和(76.5±3.3)%;凋亡率可达(53.6±3.8)%和(48.3±4.3)%,与吉西他宾组[(24.8±2.9)%和(21.8±3.5)%]相比,差异有统计学意义(P<0.01).在裸鼠体内,各治疗组均可抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长;联合组肿瘤的体积和增殖凋亡指数分别为(262±37)mm~3和(50±4)%,与吉西他宾组[(384±56)mm~3和(25±3)%]相比,差异有统计学意义(P<0.05).EMSA和Western blot结果显示,二氢青蒿素能抑制胰腺癌细胞NF-κB与DNA结合活性,联合组较吉西他宾组NF-κB活性有显著的降低;二氢青蒿素下调BxPC-3和Pane-1细胞核P65的表达,联合组较对照组显著下调NF-κB靶基因蛋白Cyclin D1、Bcl-xL、Bel-2的表达,上调Bax的表达,降低Bel-2/Bax的比例,进一步增加Caspase-3的活化.结论 二氢青蒿素抑制吉西他宾所诱导激活的NF-κB的活性,下调NF-κB下游靶基因蛋白的表达可能是其增敏吉西他宾抗胰腺癌作用的分子机制.     

胰腺癌肿瘤干细胞对抗肿瘤药物敏感性的实验研究

目的 探讨胰腺癌肿瘤干细胞对抗肿瘤药物的敏感性.方法 FACS技术分选人胰腺癌PANC-1细胞;RT-PCR技术检测分选PANC-1细胞中CD133、ABCG2、Notch1的表达情况;MTT法检测分选细胞对抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶和吉西他滨的耐药性.建立分选细胞的移植瘤模型,随机分为吉西他滨治疗组(n=3)和对照组(n=3),观察肿瘤生长情况,作CD133免疫组化染色.结果PANC-1细胞中含有SP亚群.SP细胞CD133、ABCG2、Notch1的mRNA的表达明显上调,non-SP细胞的表达量显著低于前者.在吉西他滨的干预下,SP细胞和non-SP细胞的OD值差异有统计学意义.而5-氟尿嘧啶的干预(10 μg/ml和100 μg/ml)则没有显著差异.移植肿瘤治疗组中CD133阳性细胞明显多于对照组(P=0.001).结论胰腺癌中存在SP亚群细胞.胰腺癌PANC-1的成瘤能力是由其中的SP亚群细胞决定的,而并非所有胰腺癌PANC-1细胞.胰腺癌肿瘤干细胞对抗肿瘤药吉西他滨具有较高耐药性.     

Hedgehog信号通路相关蛋白在人胰腺癌SW1990耐药株中的表达及意义

目的:探讨Hedgehog信号通路蛋白在人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990中的表达,为克服胰腺癌获得性耐药提供实验基础。方法:采用浓度梯度递增法建立人胰腺癌SW1990耐药株,采用噻唑蓝法测定SW1990亲代与耐药细胞IC50。实时荧光定量PCR检测亲代与耐药细胞mRNA中hedgehog信号通路成员Shh、SMO、Gli-1的表达差异。Western印迹法检测亲代与耐药细胞中上述蛋白质的表达。结果:人胰腺癌耐药株SW1990的IC50从亲代的(3.1±0.2)μmol/L提高到(232.2±12.3)μmol/L。荧光定量PCR结果显示耐药株中Shh、Gli-1的表达提高了(12.07±1.71)倍和(4.15±0.42)倍。亲代SW1990中未检测到SMO表达,而耐药细胞中却可以检测到SMO的表达。Western印迹结果同样显示,人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高表达上述蛋白质。结论:人胰腺癌耐药株中高表达部分hedgehog信号通路蛋白。针对hedgehog信号通路的靶向治疗可能为克服胰腺癌耐药提供新的理论基础。     

小檗碱对结肠癌细胞HT-29增殖、凋亡及细胞膜钾通道的作用

目的 观察小檗碱(Berberine,以下简称"Ber")对结肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡的作用并探讨其离子通道机制.方法 Ber 0.1～30.0μmol/L处理HT-29细胞.氮蓝四唑盐法检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡率,膜片钳检测延迟整流钾通道[IK(V)].结果 0.1～30.0μmoL/L Ber均可抑制HT-29细胞增殖(P<0.05),其抑癌率与作用时间及浓度相关;HT-29细胞经Ber处理24 h后,凋亡率明显增高(P<0.05),0.1、0.3、3.0、30.0μmoL/L Ber组凋亡率分别为(7.6±1.8)%、(9.8±2.1)%、(22.3±4.2)%、(40.6±4.5)%,对照组凋亡率为(2.4±1.1)%;0.3、3.0、30.0μmoL/L的Ber能浓度依赖性抑制结肠癌细胞IK(V)(P<0.01),阶跃刺激为+80 mV时,对照组、0.3、3.0、30.0μmol/L Bet组IK(V)分别为(488±42)、(376±22)、(296±25)、(225±34)pA,0.3、3.0、30.0μmol/L Ber处理组IK(V)分别为对照组的(77.16±5.41)%、(61.35±6.09)%、(45.87±7.62)%.结论 Ber具有抑制结肠癌细胞HT-29增殖并诱导其凋亡的作用,此作用可能与Ber抑制肿瘤细胞细胞膜钾离子通道开放有关.     

Survivin siRNA纳米载体的制备及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响

目的：利用纳米技术和基因干扰技术设计并合成携载survivin siRNA的纳米载体,探讨survivins iRNA纳米微粒对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖和凋亡的影响。方法：体外培养人胰腺癌BXPC-3细胞,将BXPC-3细胞随机分为4组：生理盐水组、不含基因的纳米微粒组、survivin siRNA组和s urvivins iRNA纳米微粒组。RT-PCR检测survivin mRNA的表达;Wes tern blot法检测s urvivin蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞增殖情况。结果：细胞培养72 h后,survivin siRNA纳米微粒组细胞的survivin mRNA和蛋白表达均低于其他3组（P〈0.05）。survivin siRNA纳米微粒组细胞增殖明显受抑制,生长缓慢,而细胞凋亡率高于其他3组（P〈0.05）。结论：survivin siRNA纳米微粒能够有效减少胰腺癌BXPC-3细胞survivin mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞的凋亡,显著抑制BX-PC-3细胞的增殖。     

异硫氰酸苯乙酯诱导胆管癌细胞凋亡和细胞周期阻滞的实验研究

目的:探讨异硫氰酸苯乙酯(PEITC)对人胆管癌QBC-939细胞凋亡和细胞周期的影响。方法:PEITC处理QBC-939细胞后,采用MTT法检测细胞活力;运用流式细胞技术检测细胞凋亡率;Hoechst33342染色后荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态;使用流式细胞技术检测细胞周期。设置对照组:加入和药物等体积的DMSO。结果:20、30、40、50μmol/L的PEITC作用于QBC-939细胞24 h后,细胞活力分别为(88.07±2.40)%、(68.02±4.04)%、(52.57±1.91)%、(36.37±3.42)%,较对照组明显降低(P<0.05);30μmol/L的PEITC处理QBC-939细胞12、18、24、48 h后,细胞活力分别为(90.74±2.96)%、(78.22%±4.85)%、(69.67±4.58)%、(40.48±2.59)%,较对照组明显降低(P<0.05)。QBC-939细胞经30μmol/L和50μmol/L的PEITC作用处理24 h后,细胞凋亡率分别为(30.51±2.77)%、(58.62±3.75)%,较对照组显著升高(P<0.05);G2/M期的细胞比例从(5.06±1.86)%上升到(16.96±2.71)%、(26.68±1.85)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PEITC可通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞而发挥抗胆管癌作用,并具有时间-剂量依赖性。     

大黄素对精索静脉曲张缺氧模型精原细胞的保护作用

目的观察大黄素对精索静脉曲张缺氧模型精原细胞的保护作用。方法选用小鼠GC-1精原细胞,设置对照组(A组)、对照+大黄素组(B组)、模型组(C组)、模型+大黄素组(D组)。C组和D组加入氯化钴(CoCl2)至终质量浓度为100μmol/L,然后培养细胞24 h构建精索静脉曲张缺氧模型。B组和C组加入大黄素至终质量浓度为40μmol/L。采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法及流式细胞仪测定细胞凋亡水平,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)的蛋白质表达水平,采用实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞Caspace-3和bax的基因表达水平,组间比较采取t检验。结果CCK-8实验示C组和D组细胞存活率低于A组[(51.70±3.52)%、(77.84±5.18)%比(100.00±0.00)%,t=23.767、7.410,P值均<0.05],差异有统计学意义,且D组细胞存活率高于C组[(77.84±5.18)%比(51.70±3.52)%,t=7.229,P<0.05],差异有统计学意义。流式实验示D组凋亡细胞比例低于C组[(10.54±0.68)%比(21.23±1.01)%,t=15.207,P<0.05],差异有统计学意义。Western blot结果示D组Caspace-3和bax蛋白表达水平低于C组(0.713±0.020、0.819±0.022比1.134±0.025、1.271±0.019,t=22.722、26.813,P值均<0.05),差异有统计学意义。RT-qPCR结果示D组Caspace-3和bax表达水平低于C组(1.52±0.18、1.80±0.21比3.53±0.23、4.27±0.31,t=11.920、11.426,P值均<0.05),差异有统计学意义。结论大黄素通过抑制细胞凋亡对精索静脉曲张缺氧模型的精原细胞起保护作用。     

内源性大麻素诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡中Caspase-3的作用

目的 检测内源性大麻素(AEA)是否诱导人肝癌高转移细胞株MHCC97H细胞凋亡、以及Caspase-3在细胞凋亡过程中的作用.方法 分别于AEA(100 μmol/L)作用细胞前后,应用Annexin V Binding方法 、流式细胞仪检测细胞凋亡率;荧光活性检测试剂盒检测细胞Caspase-3活性;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 ,检测Caspase-3、bcl-2及bax的mRNA表达.结果 AEA作用细胞3、6、12、24 h,细胞凋亡率分别为(14.13±2.17)%、(27.04±3.21)%、(34.98±7.74)%及(81.35±9.71)%,其中24 h的细胞凋亡率与对照组(12.72±0.44)%比较,差异有统计学意义(P<0.01).AEA作用细胞24 h,细胞的Caspase-3活性由142.0±5.8增加至226.0±6.4(P<0.01);Caspase-3 mRNA的表达由0.24±0.13升高至0.54±0.32(P<0.05);如预先加入Caspase-3抑制剂(Z-VAD-FMK)后再加入AEA,则细胞的Caspase-3活性不再升高90.0±4.3.RT-PCR方法 未检测到bcl-2 mRNA及bax mRNA的表达.结论 AEA对人肝癌高转移细胞MHCC97H具有凋亡诱导作用,Caspase-3参与了凋亡的调控.     

TOPK抑制剂HI-TOPK-032对胰腺神经内分泌肿瘤BON-1细胞体外恶性表型的影响

目的 杀伤性T细胞来源的蛋白激酶（T-lymphokine activated killer cell-originated protein kinase,TOPK）高表达与肿瘤增殖、凋亡、侵袭和转移密切相关。本研究旨在探讨使用TOPK抑制剂HI-TOPK-032对胰腺神经内分泌肿瘤细胞BON-1体外恶性表型的抑制作用。方法 通过蛋白免疫印迹实验检测人正常胰腺导管上皮细胞和不同胰腺肿瘤细胞系中TOPK的蛋白表达水平;CCK-8实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞增殖的影响;克隆形成实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞体外克隆形成的影响;Transwell实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞仪检测HI-TOPK-032对BON-1细胞周期的影响;Annexin V检测HI-TOPK-032对BON-1细胞凋亡和坏死的影响。结果 与正常胰腺导管上皮细胞相比,胰腺神经内分泌肿瘤细胞BON-1中TOPK蛋白表达显著上调;在体外实验中,与对照组相比,在含1、2.5、5 μmol/L浓度的HI-TOPK-032培养基中,BON-1细胞增殖能力依次减弱（22.2±8.2）%、（90.4±1.0）%、（89.7±0.9）%（P＜0.001）,克隆形成依次减少（19.1±2.1）%、（42.5±5.7）%、（87.0±5.6）%（P＜0.001）,迁移能力依次减弱（9.3±5.6）%、（70.5±4.0）%、（87.5±3.5）%（P＜0.01）,侵袭能力依次减弱（23.0±4.2）%、（60.7±5.4）%、（93.6±3.0）%（P＜0.01）;在含2.5、5 μmol/L浓度HI-TOPK-032培养基中,G0/G1期的BON-1细胞比例分别增加（12.2±2.0）%、（18.3±1.4）%（P＜0.001）,在5 μmol/L浓度时,S期的细胞比例减少（18.4±6.1）%（P＜0.01）,在2.5、5 μmol/L浓度时,G2/M期的细胞比例分别减少（17.6±8.6）%、（16.4±4.5）%（P＜0.001）;HI-TOPK-032促进BON-1细胞凋亡和坏死,凋亡依次增加（60.6±30.9）%、（79.5±27.5）%、（165.8±34.9）% （P＜0.05）,5 μmol/L浓度时,坏死显著增加,增加（385.8±67.3）%（P＜0.001）。结论 TOPK靶向抑制剂HI-TOPK-032显著抑制BON-1细胞的体外恶性表型,抑制效果呈剂量依赖式。HI-TOPK-032能调控BON-1细胞周期,促进凋亡和坏死。TOPK抑制剂HI-TOPK-032可能在胰腺神经内分泌肿瘤的靶向治疗中发挥重要作用。     

自噬在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的作用

目的:研究自噬在吉西他滨(gemcitabine,Gem)诱导胰腺癌细胞SW1990凋亡中的作用,并以氯喹特异性抑制自噬,以探讨其可能机制。方法:采用CCK8法检测Gem对胰腺癌细胞增殖的影响,并用实时定量PCR检测自噬相关基因LC3的表达,以p62免疫荧光染色检测细胞内自噬泡,通过Western印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达,并用AnnexinⅤ/PI流式细胞方法检测Gem诱导后细胞凋亡的变化。进一步通过氯喹抑制自噬,检测自噬抑制前后细胞增殖、自噬及凋亡的变化。结果:Gem对胰腺癌细胞SW1990增殖具有部分抑制作用,Gem作用能迅速激活细胞自噬从而产生耐药。LC3的mRNA表达升高1.4~2.2倍(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白水平升高1.5~2.7倍(P<0.05)。Gem和氯喹联合用药组较Gem单药组细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高,细胞存活率从64.3%±3.1%降低为35.2%±3.4%(P<0.05)。结论:自噬在Gem诱导胰腺癌细胞凋亡的过程中可能起到保护作用,氯喹抑制自噬后可增强Gem的促凋亡作用。     

氯胺酮复合咪达唑仑对谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的影响

目的 探讨氯胺酮复合咪达唑仑对谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的影响.方法 诱导分化4 d的神经元样PC12细胞随机分为5组:对照组(c组);谷氨酸组(Glu组)加入20 mmol/L谷氨酸;氯胺酮组(K组)、咪达唑仑组(M组)、氯胺酮+咪达唑仑组(K+M组)均加入20 mmol/L谷氨酸后,分别加入50 μmol/L氯胺酮、1μmol/L咪达唑仑、50 μmol/L氯胺酮+1 μmol/L咪达唑仑.各组细胞继续培养24 h后采用MTT法检测细胞活力,Hoechst33258核染色法及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡细胞.结果 与C组比较,Glu组细胞活力降低,细胞凋亡率升高(P<0.01);与Glu组比较,K组和M组细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P<0.05);与K组和M组比较,K+M组细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P<0.05);K组和M组细胞活力及细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05).结论 氯胺酮复合咪达唑仑可更有效地抑制谷氨酸诱导PC12细胞凋亡.