雷公藤甲素体内代谢产物研究

目的：研究配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠体内的代谢产物,为阐明甘草对雷公藤的减毒增效机制以及指导雷公藤甲素代谢产物的分离鉴定奠定基础。方法：采用高效液相色谱二极管阵列结合电喷雾离子肼多级质谱（ HPLC－DAD－ESI／Trap／MSn ）法研究配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠尿液中的代谢产物。结果：在大鼠尿液中发现雷公藤甲素代谢产物4个,分子量分别为376（M1）,376（M2）,374（M3）和390（M4）。根据DAD紫外光谱图、电喷雾离子肼多级质谱以及药物体内代谢特点初步鉴定为：2（或5）－羟基雷公藤甲素（M1,M2）,2－羰基雷公藤甲素（M3）,2－羰基－5－羟基雷公藤甲素（M4）。结论：氧化代谢产物为雷公藤甲素的主要代谢产物,氧化代谢可能为雷公藤甲素的解毒途径。     

雷公藤内酯醇联用甘草次酸的药代动力学研究

目的 探讨甘草次酸对雷公藤内酯醇在大鼠体内的药代动力学行为的影响. 方法 将SD大鼠随机分为雷公藤内酯醇单独给药组和雷公藤内酯醇与甘草次酸联合给药组,分别通过尾静脉注射雷公藤内酯醇0.2 mg/kg,采用液相色谱-质谱法(LC-MS),选择离子检测(SIM)的方式测定2组大鼠不同时间血浆中的雷公藤内酯醇浓度,比较2组在大鼠体内的药代动力学行为. 结果 在0.2～250 ng/mL质量浓度范围内,血浆中雷公藤内酯醇线性良好.定量下限为0.2 ng/mL,日内和日间精密度RSD均<12.0％,准确度为90％～105％,绝对回收率>80％,基质效应>90％,血浆样品的稳定性良好.药代动力学数据显示,联合给药组的最大血药浓度(cmax)、消除半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT0～180 min)、血药浓度|时间曲线下面积(AUC0～180 min)分别是单独给药组的0.75,2.51,1.15及1.39倍,其中t1/2、MRT0～180 min在2组间的差别有统计学意义(P<0.05). 结论 甘草次酸与雷公藤内酯醇联用可降低雷公藤内酯醇的峰浓度,延长其体内滞留时间,从而提高其大鼠体内的生物利用度;该测定方法简便、效率高、重复性好,符合生物样品分析的基本要求.     

GC/TOF-MS代谢组学技术研究雷公藤甲素在大鼠体内的急性毒性

采用GC/TOF-MS代谢组学技术研究雷公藤甲素对大鼠尿液中内源性小分子化合物的影响和毒性作用机制,寻找与毒性相关标志物,为雷公藤类药物临床毒性的早期预防和诊断提供依据。SD大鼠随机分为4组,分别为雷公藤甲素高(2.4 mg/kg)、中(1.2 mg/kg)、低(0.6 mg/kg)剂量组及空白对照组。单次灌胃给药后,收集第0、1、3和7天的尿液,GC/TOF-MS进行分析,对尿液中内源性小分子化合物进行鉴定并获取半定量数据,经过主成分分析发现:不同剂量给药和不同时间取样尿液中内源性小分子代谢谱有明显差异,可被清晰区分并呈明显的动态变化轨迹。代谢组学数据分析结果与常规血液生化和组织病理学检查结果基本吻合。研究结果发现,给药引起尿液中的苹果酸、枸橼酸、牛磺酸、谷氨酸、苏氨酸及软脂酸等发生明显改变,提示与雷公藤甲素毒性相关,为潜在的毒性标志物。本研究结果表明,通过测定尿液中小分子代谢物可反映雷公藤甲素对大鼠的毒性,代谢组学技术可以作为药物毒性评价方法。代谢通路分析结果提示,雷公藤甲素对肝脏的毒性机制可能与大鼠肝脏线粒体受损、影响三羧酸循环、氨基酸代谢及脂质代谢有关。     

雷公藤甲素与双氢青蒿素配伍对大鼠佐剂性关节炎的免疫学研究

目的：从病理及免疫学的角度观察小剂量的雷公藤甲素与双氢青蒿素配伍对大鼠佐剂性关节炎的影响,探讨能否通过减少雷公藤甲素的用量而降低药物的毒性。方法：将70只雄性SD大鼠随机分为7组（即正常组,模型组,雷公藤甲素高、低剂量组,雷公藤甲素双氢青蒿素高、中、低剂量组）。动物模型用弗氏完全佐剂于SD大鼠右后足跖皮内诱导关节炎发生。给药组治疗1个月后取血并处死动物,取关节进行病理学分析,并运用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群、免疫组化染色法检测踝关节软骨上的IL-6、TNF-α的表达。结果：与模型组相比,雷公藤甲素双氢青蒿素配伍可明显抑制AA大鼠的关节病理损伤,能显著降低外周血CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋水平及降低踝关节软骨上的IL-6、TNF-α的表达（P〈0.01）,且与雷公藤甲素高剂量组比较则无差异（P〉0.05）,优于雷公藤甲素低剂量组（P〈0.05）。结论：通过与双氢青蒿素配伍可以减少雷公藤甲素的用量。     

雷公藤多苷片对缬沙坦在大鼠体内药代动力学的影响

目的研究大鼠合用雷公藤多苷片和缬沙坦后,雷公藤多苷片对缬沙坦药代动力学的影响。方法 16只雄性SD大鼠,随机分为单独给药组和联合给药组两组,其中单独给药组灌胃缬沙坦(20 mg/kg),联合给药组灌胃雷公藤多苷片(10 mg/kg)和缬沙坦(20 mg/kg)。不同时间点取血并采用LC-MS测定缬沙坦的血药浓度,计算药代动力学参数。结果与单独给药组相比,联合给药组缬沙坦的最大血药浓度[(1.57±0.32)vs(1.01±0.28)μg/m L]和血浆曲线下面积[(10.01±0.58)vs(6.82±0.77)mg·h/L]明显增加(P0.05),说明缬沙坦的代谢受到明显抑制。结论雷公藤多苷片与缬沙坦联用之后,会对缬沙坦的药代动力学产生明显的影响,本研究对缬沙坦和雷公藤多苷片联合用药具有一定的指导作用,可以避免临床药物不良相互作用的发生。     

UPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中雷公藤内酯醇及其药代动力学

目的建立大鼠血浆中雷公藤内酯醇的超高效液相色谱质谱联用(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometer/mass spectrometer,UPLC-MS/MS)法测定大鼠灌胃给药与静脉注射给药后的血浆药物浓度,并进行药代动力学参数评价。方法 Sprague Dawley大鼠分别经灌胃与尾静脉注射给药,经颈静脉取血,测定不同时间的大鼠血浆药物浓度,并计算其主要药代动力学参数。结果在0.1~200.0 ng/m L质量浓度范围内,血浆雷公藤内酯醇线性关系良好,血浆中雷公藤内酯醇的定量限为0.1 ng/m L,该药稳定性良好,回收率均在95%以上,日内与日间差异均小于15%。口服与静脉给药后,雷公藤内酯醇在大鼠体内的消除均较快,口服生物利用度为9.5%。结论本实验操作简便、稳定可靠、检测限低、效率高、重现性好,可以可靠地用于雷公藤内酯醇血药浓度测定及其药代动力学研究,本研究结果为雷公藤内酯醇的结构优化、剂型改进以及临床应用提供了实验依据。     

一测多评法同时测定雷公藤提取物中0种成分含量

目的建立一测多评法（QAMS）同时测定自制雷公藤提取物6种有效成分的含量。方法采用QAMS法,以雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲6种成分为研究对象,对外标法和校正因子法的实测值及计算值的差异进行分析。结果 6种指标成分在一定范围内线性关系良好,以雷公藤甲素为内参物,雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的fk/s分别为0.654、1.221、0.347、1.238、0.079,且在不同条件下重复性良好;3批样品中各成分含量分别为雷公藤甲素0.037～0.038mg/g、雷公藤内酯酮0.245～0.253 mg/g、雷酚内酯6.165～6.325 mg/g、雷公藤次碱14.439～15.065 mg/g、雷公藤红素1.699～1.856 mg/g、雷公藤内酯甲20.946～21.819 mg/g,且计算所得量与实测量测得结果无显著差异。结论QAMS法适用于雷公藤提取物的含量测定,可为雷公藤的质量控制提供参考。     

小剂量雷公藤内酯醇对荷卵巢癌大鼠体内抑瘤作用的观察

目的研究小剂量雷公藤内酯醇对荷卵巢癌大鼠体内抗肿瘤作用。方法将40只F344大鼠右腋窝接种F344大鼠卵巢上皮低分化腺癌细胞株细胞悬液,成瘤后随机分为5组：空白荷瘤组,顺铂组,0.1、0.05、0.025mg雷公藤内酯醇组,每组8只。上述5组大鼠分别给予腹腔注射生理盐水2mL/d,顺铂3mg/（kg·d）,雷公藤内酯醇0.1、0.05、0.025mg/（kg·d）,均隔天给药,连续10d。结果0.025、0.05、0.1mg雷公藤内酯醇组对大鼠卵巢癌皮下瘤具有明显的抑瘤作用,抑瘤率分别为27.85%、35.63%、49.34%;上述3组大鼠瘤重与空白荷瘤组相比,有显著差异（P〈0.01或P〈0.05）。结论雷公藤内酯醇在体内具有抑制大鼠卵巢癌的作用。     

雷公藤甲素亚急性中毒对Wistar大鼠的肾脏毒性作用

目的：观察雷公藤甲素对Wistar大鼠的毒性及肾脏损伤作用,并初步探讨其机理。方法：大鼠灌胃雷公藤甲素0,200和300μg/kg14d,分别于给药0,7和14d时测定大鼠体重。实验结束时取肾脏进行免疫组织化学和蛋白质印迹法（western blot）检测。结果：给药后动物体重呈现增长减慢以及下降现象,肾脏切片中死亡受体（Fas）及其配体（FasL）表达增加,肾脏细胞中细胞色素C由线粒体转移至胞浆。结论：雷公藤甲素可引起受试动物肾脏出现凋亡损伤。     

不同给药方式下家兔尿液中乌头碱代谢产物的比较

目的：研究不同给药方式下家兔尿液中的乌头碱(AC)代谢产物,探讨不同代谢产物的作用。方法：5只家兔分为AC　1.0 mg•kg^-1灌胃给药组、0.02 mg•kg^-1静脉给药组及空白对照组,收集代谢产物,采用LC/ESI-MSn方法,通过测定化合物的准分子离子和各级碎片离,推断尿液中存在的代谢产物。结果：与空白对照组比较,静脉给药组尿液中除原形药物外主要有1种代谢产物(M1),灌胃给药组除原形药物外主要有2种代谢产物(M1,M2);M1为16-O-去甲基乌头碱,M2为乌头碱去氧去甲基产物;M1和M2可能为AC失去1个亚甲基和脱去1个羟基所形成的代谢产物。结论：AC经不同体内代谢方式得到2种代谢产物,与AC原型相比,2种代谢产物与AC的药理及毒理作用密切相关。     

甘草与海藻配伍对甘草高效液相指纹图谱的影响

目的：建立甘草的HPLC指纹图谱,研究甘草海藻不同比例配伍对甘草指纹图谱的影响。方法：采用反相高效液相色谱法,选用Kromasil C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相为乙腈-0.08%磷酸水溶液（梯度洗脱）,分析时间70min,检测波长为235nm。结果：该方法稳定、可靠、重复性好,可用于甘草药材指纹图谱的测定。标定了甘草指纹图谱21个共有指纹峰,考察了这21个共有峰峰面积在不同比例配伍中的变化。结论：甘草海藻不同比例配伍对甘草指纹图谱的影响显著。     

妊娠母鼠静脉注射葡萄球菌肠毒素B对胎鼠胸腺发育的影响

目的: 观察妊娠母鼠静脉注射葡萄球菌肠毒素B (SEB)对胎鼠胸腺发育的影响。方法: 将孕鼠随机分为实验组及对照组,每组12只;实验组和对照组孕鼠在妊娠第16天分别尾静脉注射SEB 15 μg和等体积的生理盐水;于妊娠21天打开母鼠腹腔取出胎鼠,称量胎盘、胎鼠及其胸腺的湿重和干重;胎鼠胸腺细胞以抗CD4-APC及抗CD8-PE双标染色后用流式细胞仪检测T淋巴细胞各亚群。结果: 妊娠母鼠静脉注射SEB后可明显减少胎鼠胸腺的湿重和干重(P < 0.01),减少CD4-CD8+、CD4+CD8+T细胞(P < 0.01和P < 0.05),但明显增加CD4+CD8-T细胞(P < 0.01);胎鼠和胎盘的干、湿重与对照组差异均无统计学意义(P > 0.05)。结论: SEB可明显影响胎鼠胸腺的发育。     

乌贼墨对小鼠T细胞亚群和T细胞活化的影响

目的：研究乌贼墨对小鼠T细胞亚群和T细胞活化的影响。方法：实验组小鼠每天灌胃5%的乌贼墨0.5ml,连续7d。对照组小鼠给予等量生理盐水。流式细胞术检测小鼠外周血CD4^＋T细胞百分比、CD4^＋/CD8^＋比值及IL-2αR（CD25）表达。结果：实验组小鼠外周血CD4^＋T细胞百分比、CD4^＋/CD8^＋比值及IL-2αR（CD25）表达较对照组小鼠均有明显升高,而CD8^＋T细胞却无显著性变化。结论：乌贼墨通过增高CD4^＋T细胞百分比、CD4^＋/CD8^＋比值及IL-2αR（CD25）表达对小鼠免疫功能进行调节。     

强效抗逆转录治疗对艾滋病患者CD4^＋ T淋巴细胞的动态影响

目的观察强效抗逆转录治疗对艾滋病患者CD4^＋T淋巴细胞的动态影响。方法分析25例患者在治疗前（DO）和抗逆转录病毒（HAART）治疗第3、6、12个月时外周血中CD4^＋T淋巴细胞、CD4^＋T淋巴细胞百分率的动态变化。结果AIDS患者组与正常对照组CD4^＋T淋巴细胞、CD4^＋T淋巴细胞百分率指标间差异存在非常显著性（t=24.98、t=11.61,P均〈0.001）。25例患者DO前根据CD4^＋T淋巴细胞数量分为Ⅰ组（〈100个/μL）、Ⅱ组（100~200个/μL）、Ⅲ组（〉200个/μL）,经3、6、12个月HAART治疗后CD4^＋T淋巴细胞、CD4^＋T淋巴细胞百分率指标均有不同程度提高,各组与DO前比较：Ⅰ组P均〈0.01、Ⅱ组CD4^＋T淋巴细胞P〈0.05、CD4^＋T淋巴细胞百分率指标P〉0.05、Ⅲ组P均〉0.05。Ⅰ组DO前CD4^＋T淋巴细胞、CD4^＋T淋巴细胞百分率指标最低,经12个月治疗后CD4^＋T淋巴细胞、CD4^＋T淋巴细胞百分率指标增加最为明显。有关CD4^＋T淋巴细胞绝对数的增加比较：Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组比较,P均〈0.01;Ⅱ组与Ⅲ组比较,P〉0.05。结论HAART能有效回升AIDS患者CD4^＋T淋巴细胞数量,提示HAART治疗对CD4^＋T淋巴细胞数量越低患者疗效越为显著。     

活化单倍相合异基因造血干细胞治疗晚期难治性肾癌的疗效观察

目的：探讨活化单倍相合异基因造血干细胞（haplo—HSCs）治疗晚期难治性肾癌的安全性和有效性。方法：10例晚期肾癌患者入组,均接受1个疗程的haplo—HSCs治疗,分别通过影像学检查、生活质量（KPS评分）以及外周血淋巴细胞亚群、细胞因子变化情况来评估临床疗效和免疫学反应。结果：（1）10例患者中,2例部分缓解（PR）,6例疾病稳定（SD）,2例疾病进展（PD）,有效率（CR＋PR）为20％,临床获益率（CR＋PR＋SD）为80％。中位随访时间21个月,中位达进展时间（mTTP）为5．7个月,中位生存时间为16个月,1年生存率为70％。（2）治疗后患者的CD3^＋、CD4^＋、CD4^＋／CD^8＋．CD3^-CD16^＋56^＋（NK）均明显升高（P〈0．05）,而CD8^＋、CD4^＋CD25^＋（Tregs）明显降低（P〈0．05）;TNF—α、IFN-γ等Th1类细胞因子明显升高（P〈0．01）,而TGF-β明显下降（P〈0．05）。（3）除一过性的发热、乏力外,未出现其他不良反应。结论：晚期难治性肾癌患者,采用活化haplo—HSCs治疗可以增强自身免疫功能,提高生存率和生活质量,并且有良好的耐受性。     

季节变化对健康人免疫功能的影响

目的：动态观察季节变化对健康人免疫功能的影响.方法：对20例大学生志愿者分别在春分（VE）、夏至（SS）、秋分（AE）、冬至（WS）4个实验日分为VE组、SS组、AE组、WS组,应用流式细胞术对外周血CD3^＋,CD4^＋,CD8^＋,CD56^＋进行分析;应用放射免疫法检测血清中IL-1β,IL-2,IL-6及唾液中sIgA,IgG水平;应用酶联免疫吸附法检测血清中IFN-γ水平.结果：CD4＋VE组高于WS组（P〈0.05）;IL-2,IL-6高于AE组[（5.39±1.17）vs（4.02±0.89）,（106.79±62.98）vs（95.87±39.43）,P〈0.05];IFN-γ（3.82±0.18）高于WS组（2.72±0.92）;CD3^＋和CD4^＋/CD8^＋比值SS组高于VE组、AE组、WS组（P〈0.05或P〈0.01）;CD8^＋而则低于后者,CD4^＋高于WS组（P〈0.01）;IL-1β,IL-2及IFN-γ高于AE组[（0.21±0.15）vs（0.14±0.23）,（6.47±1.82）vs（4.02±0.89）,（4.58±0.21）vs（2.72±0.92）,P均〈0.05];IL-2,IFN-γ高于WS组[（6.47±1.82）vs（3.55±1.02）,（4.58±0.21）vs（2.58±3.79）,P〈0.05或P〈0.01];sIgA,IgG高于WS组[（95.98±56.35）vs（84.99±39.82）,（21.05±10.11）vs（18.03±9.27）,均P〈0.05].结论：机体免疫功能存在春夏高,秋冬低的季节节律,季节对免疫功能的调节可能是通过T淋巴细胞及其免疫网络进行的.     

玉屏风散对Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠免疫调节的影响

目的：探讨玉屏风散对肝癌荷瘤小鼠机体免疫的调节作用。方法：采用皮下接种Hepa1-6肿瘤细胞建立肝癌荷瘤C57BL／6小鼠模型;应用流式细胞技术检测和分析荧光标记的免疫细胞亚群。结果：玉屏风散20、25、30g生药·kg“对Hepa1-6肝癌荷瘤C57小鼠的抑瘤率分别为18．86％、28．81％、37．44％。与模型对照组比较,玉屏风散组胸腺重量和胸腺指数无变化,脾重和脾脏指数均呈上升趋势,脾脏中CD19^＋B细胞数量、CD19^＋CD80^＋B细胞比例、巨噬细胞比例和数量、CD4^＋T和CD8^＋T细胞数量以及肿瘤组织中CD4^＋T和CD8^＋T细胞比例均显著增加（P〈0．05,P〈0．01）,而脾脏中CD19^＋B细胞、CD4^＋T和CD8^＋T细胞的比例均无变化（P〉0．05）。结论：玉屏风散对肝癌荷瘤小鼠机体免疫具有广泛调节和增强作用,为玉屏风散在临床抗肝癌中的合理应用提供了实验依据。     

细胞免疫对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响

目的通过检测宫内感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）婴幼儿外周血T细胞亚群的变化,进一步探讨乙型肝炎疫苗免疫失败的机制。方法选择HBV宫内感染免疫失败婴幼儿20例和免疫成功者29例,采用流式细胞术及荧光染色法,检测外周血T细胞亚群CD3^＋、CD4^＋和CD8^＋的变化。结果免疫成功组婴幼儿外周血CD3^＋为64.17%±8.01%,CD4^＋为39.55%±8.80%,CD8^＋为24.62%±7.23%;CD4^＋/CD8^＋比值为1.66±0.51。免疫失败组婴幼儿外周血CD3^＋、CD4^＋和CD8^＋分别为62.55%±7.32%、32.94%±7.58%和29.61%±7.08%;CD4^＋/CD8^＋比值为1.13±0.50。统计分析显示,CD3^＋T淋巴细胞百分数组间差异无显著性意义（P〉0.05）,CD4^＋T和CD8^＋T细胞在免疫失败组和免疫成功组有显著性差异（P〈0.05）。结论婴幼儿外周血CD4＋和CD8＋T细胞的数量变化可能是乙肝疫苗免疫接种失败的机制之一。     

粒巨细胞集落刺激因子联合异体肿瘤细胞疫苗治疗晚期实体瘤的疗效观察

目的：探讨粒巨细胞集落刺激因子（GM—CSF）联合异体肿瘤细胞疫苗的安全性和有效性。方法：收录病理明确的Ⅳ期癌症患者60例,其中恶性黑色素瘤11例,卵巢癌10例,肾癌15例,胃／结直肠癌14例,乳腺癌10例。每周皮下注射肿瘤细胞和GM—CSF分泌细胞混合物1ml;共6次。在第1,5次注射同时,进行DTH接种试验。治疗前后取外周血样进行淋巴细胞亚型及细胞因子检测。治疗完成1个月后进行影像学检查。结果：所有病人对治疗耐受良好,无脱组患者。主要不良反应为,注射局部红肿疼痛,硬结,瘙痒和发热。4例治疗后有影像学好转但未达到部分缓解,40例稳定,16例进展。DTH阳性率68％（41／60）。流式细胞仪检测治疗后CD8^＋T细胞（CTL）明显增加（P〈0．05）,CD4^＋CD25＋CD127-T细胞（Treg）降低（P〈0．05）。ELISA检测IFN-γ治疗前后的变化无统计学意义,但有升高趋势。结论：异体GM—CSF联合肿瘤细胞疫苗治疗安全,耐受良好,能改善患者的机体免疫状态。