人DNA修复基因hR24L参与细胞周期检定点调控

目的：研究酵母ＲＡＤ２４Ｌ基因功能，克隆人类同源物。方法：分离ＲＡＤ２４基因区域ｒａｄ２４Ｌ突变株，以人的ｃＤＮＡ表达文库转化突变株，筛选回复表型；大剂量Ｘ线照射观察细胞周期。结果：ｒａｄ２４Ｌ对紫外线敏感，从转化文库后的回复表型中克隆出人类ｈＲ２４Ｌ全长ｃＤＮＡ。结论：克隆的人类ＤＮＡ修复基因ｈＲ２４Ｌ，它能校正ｒａｄ２４Ｌ的突变表型，参与细胞周期检定点调控。     

人DNA修复基因hR24L参与细胞周期检定点调控

目的：研究酵母ＲＡＤ２４Ｌ基因功能,克隆人类同源物。方法：分离ＲＡＤ２４基因区域ｒａｄ２４Ｌ突变株,以人的ｃＤＮＡ表达库转化突变株,筛选回复表型;大剂量Ｘ线照射观察细胞周期。结果：ｒａｄ２４Ｌ对紫外线敏感,从转化库后的回复表型中克隆出人类ｈＲ２４Ｌ全长ｃＤＮＡ。结论：克隆的人类ＤＮＡ修复基因ｈＲ２４Ｌ,它能校正ｒａｄ２４Ｌ的突变表型,参与细胞周期检定点调控。     

紫外线照射对DNA修复基因RAD24转录的影响

目的：紫外损伤对ＤＮＡ修复基因ＲＡＤ２４转录的影响，方法：以酿酒酵母ＨＹ６８４为实验对象，用波长２５４ｎｍ紫外线分别在０，３７，５０和７０Ｊ／ｍ＾２等强度下照射下不同时间，提取总ＲＮＡ，应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测ＲＡＤ２４基因转录水平的变化，结果：３７Ｊ／ｍ＾２及５０Ｊ／ｍ＾２分别照射２０～１２０ｍｉｎ明显提高ＲＡＤ２４基因转录水平。结论；低剂量紫外线照射可提高ＲＡＤ２４基因转录水平，该基因     

人类DNA修复蛋白hR24Lp具有转录激活作用

hR24L是本实验室首次用遗传互补法克隆出的人类DNA修复基因,它与酵母RAD24L(又称RAD24)基因同源.人类hR24L基因能校正酵母RAD24L突变株的紫外线敏感表型和X线敏感表型,参与DNA切除修复和重组修复.     

紫外线照射对DNA修复基因RAD24转录的影响

目的：紫外损伤对ＤＮＡ修复基因ＲＡＤ２４转录的影响。方法：以酿酒酵母ＨＹ６８４为实验对象，用波长２５４ｎｍ紫外线分别在０、３７、５０和７０Ｊ／ｍ２等强度下照射不同时间，提取总ＲＮＡ，应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测ＲＡＤ２４基因转录水平的变化。结果：３７Ｊ／ｍ２及５０Ｊ／ｍ２分别照射２０～１２０ｍｉｎ明显提高ＲＡＤ２４基因转录水平。结论：低剂量紫外线照射可提高ＲＡＤ２４基因转录水平，该基因的表达具有损伤诱导性。     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

人瘦素基因克隆与序列测定

目的 构建人瘦素基因ｃＤＮＡ克隆，并进行序列分析。方法 用逆转录聚合酶链反应扩增人瘦素基因ｃＤＮＡ获得片段（６４０ｂｐ）连接至ｐＵＣ１９载体，并转化大肠杆菌ＤＨ５α。以末端终止法进行序列测定。结果 所克隆的人瘦素ｃＤＮＡ含全长的人瘦素基因编码区，仅２８７位的腺苷酸被鸟苷酸代谢，导致９６位编码谷氨酰胺的密码子ＣＡＡ改变为编码精氨酸的ＣＧＡ，其意义尚待阐明。结论 以逆转录聚合酶链反应方法成功地构建了人     

小鼠凋亡相关新基因TFAR19 cDNA的克隆化和序列分析

目的：了解一个细胞凋亡相关新基因ＴＦＡＲ１９在不同种属间的序列同源性。方法：利用表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ,ＥＳＴ）拼接技术、ＲＴＰＣＲ、ＤＮＡ序列测定技术及计算机分析技术。结果：首次成功进行了小鼠ＴＦＡＲ１９ｃＤＮＡ编码区的ｃＤＮＡ克隆化和序列分析,发现小鼠和人ＴＦＡＲ１９在核苷酸水平上有８１．４％的同源性,在氨基酸水平上有高达９６％的同源性。功能区分析发现,小鼠ＴＦＡＲ１９ｃＤＮＡ序列含编码１２６个氨基酸的开放性读码框架,含１个可能的ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ依赖的蛋白激酶磷酸化位点,４个可能的ＰＫＣ磷酸化位点。其Ｃ端的“ＥＤＤＡＤＹ”序列与人ＤＮＡ拓扑异构酶Ｉ１４１１４７位残基序列完全相同。结论：小鼠ＴＦＡＲ１９是与人ＴＦＡＲ１９高度同源的新基因,与ＤＮＡ拓扑异构酶Ｉ可能有功能相关性。     

抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及测序

目的：获取抗ＣＤ４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可变区基因，为构建抗ＣＤ４嵌合抗体打下基础。方法 从分泌抗人ＣＤ４ ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系中提取总ＲＮＡ，用家族特异性引物进行逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别扩增出重链可变区（ＶＨ）基因及轻链可变区（ＶＬ）基因。将ＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体，然后转化ＪＭ１０９细菌。并用全自动 ＤＮＡ序列分析仪对ＶＨ及ＶＬ基因序列进行测定。结果：ＶＨ基因为３５１     

hR24L基因的克隆及逆转录病毒重组体的构建

目的　克隆人类DNA损伤修复基因hR2 4L ,并构建逆转录病毒表达载体重组体 ,为进一步研究该基因的功能及作用机制奠定基础。方法　用PCR法扩增hR2 4L基因的开放阅读框 (ORF) ,然后连接到 pEGM -T载体中 ,经测序验证无突变后 ,再重组到逆转录病毒表达载体 (pDor -neo)中 ,得到正义和反义重组体。 结果　建立了一种有效的基因克隆方法 ,成功地克隆了hR2 4L基因 ,获得了含有重组体的稳定遗传的细胞株。结论　PCR法是克隆hR2 4L基因的有效方法 ,成功构建逆转录病毒表达载体重组体是研究该基因的重要前提     

hR24L基因转染对MCF7细胞周期的影响

目的　通过观察人类DNA损伤修复基因hR2 4L转染对MCF7细胞增殖周期的影响 ,进一步了解其功能及作用机制。方法　分别用正义和反义hR2 4L逆转录病毒表达载体(pDor-neo)重组体转染MCF7细胞 ,观察细胞生长速度 ,用Northern印迹杂交检测hR2 4L基因的表达情况 ,并用流式细胞仪检测细胞周期。结果　与转染空载体的细胞相比 ,转染正义hR2 4L重组体的细胞生长较慢 ,其hR2 4LmRNA的表达增加 ;而转染反义hR2 4L重组体的细胞生长较快 ,其hR2 4LmRNA的表达则降低 ;转染后 6h流式细胞仪检测表明 ,转染正义hR2 4L重组体的细胞G2 +M期的比例 (18% )明显高于其它 3种细胞 (6 % )。结论　hR2 4L基因的表达抑制了细胞生长 ,其机制是引起细胞周期阻滞 ,参与细胞周期调控。     

人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定

目的: 克隆人HOGG1基因并构建其真核表达载体,进行序列测定. 方法: 提取人胎肝总RNA,设计HOGG1特异性引物,通过RT-PCR扩增,将HOGG1基因克隆到pCMV-Myc载体,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证. 结果: 获得人HOGG1基因全长,并成功构建pCMV-Myc/HOGG1真核表达载体. 结论: HOGG1真核表达载体的构建为HOGG1基因生物靶向治疗药物的开发提供一种新的手段.     

HR24L基因过表达抑制细胞凋亡

目的:研究人类DNA 损伤修复基因HR24L与细胞凋亡的关系.方法:PCR方法扩增HR24L基因开放阅读框序列,克隆入逆转录病毒载体pDOR-neo,转染HeLa细胞,筛选阳性克隆;Southern印迹验证HR24L基因的整合状况.Northern印迹检查HR24LmRNA的细胞内表达水平.过氧化氢、丁酸钠及血清饥饿诱导凋亡,流式细胞计数仪检测凋亡比例,电泳观察DNA Ladder,Western印迹检测凋亡相关蛋白质的表达.结果:获得转染有HR24L基因的HeLa细胞.与HeLa细胞相比,HeLa-HR24L细胞HR24LmRNA表达明显上升.HR24L基因过表达导致Bcl-2的表达升高,抑制caspase-3和Bax的表达,而对p53却无明显的影响.HR24L基因过表达抑制过氧化氢和血清饥饿诱导的细胞凋亡,但对丁酸钠诱导的细胞凋亡却无抑制作用.结论:HR24L基因过表达抑制细胞凋亡.     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

人白细胞介素-24基因的克隆及序列测定

目的克隆人白细胞介素-24(hIL-24)基因，以供重组表达。方法利用自行设计合成的一对引物，采用RT-PCR技术从LPS活化的人外周血单个核细胞的总RNA中分离hIL-24cDNA并重组到pUCl9载体上，进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果PCR及酶切产物电泳结果均证明所克隆的基因为621bp。经序列测定证实所克隆的hIL-24与GenBank报道的结果完全一致。结论该基因系国内首次获得并经序列测定证实的hIL-24cDNA基因。这为进一步在真核或大肠杆菌中高效表达有活性的重组hIL-24，更深入地研究其作用机制以及临床应用奠定了坚实的基础。     

人载脂蛋白M的表达与纯化

目的:表达人细胞外全长结构域重组人载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)并将其纯化.方法:利用人类肝脏cDNA文库做模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增ApoM DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pGEXT相应住点,插入E.coli JM109,转化E.coli DL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达.结果:PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实在SDS-PAGE上出现一条560bp的基因片段.测序结果与GenBank公布的人ApoM基因序列完全一致.ApoM cDNA基因片段经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子量24 kD左右出现新的蛋白条带.结论:成功克隆出人ApoM基因,重组表达出ApoM蛋白.     

Mature insulin production by engineered non-β cells

Objective To pursue insulin and islet- transplantation replacement therapy for type 1 diab etes based on engineered human non- β cells which secrete mature insulin.Methods Human proinsulin cDNA was cloned from its genomic gene and mutated by overlap e xtension PCR, introducing furin consensus cleavage sequences (Arg- Xaa- Lys/Arg - Arg). An expression vector encoding a genetically modified human proinsulin c DNA was generated and transduced to Hela, 293, and L02 cells by lipofectin- medi ated DNA transfection. Following G418 screening, the surviving L02 cells were s elected and enriched. Insulin levels in the supernatant and cells were evaluate d using radioimmunoassay and immunofluorescence staining. Results Three sites in the insulin gene were mutated simultaneously. Insulin gene m odified cells were able to express insulin at different levels: 8.45-188.00 μIU/24 h/2.0×10(6) Hela cells and 159.88-242.14μIU/24 h/2.0×10(6) 293 cells for transient expression, and 2.56-61.95μIU/24 h/2.0×10(6) from se veral L02 clones screened with G418. No insulin was released by control cells. Furthermore, immunofluorescence staining confirmed that proinsulin was stored a s vacuoles in the cytoplasm of L02 cells.Conclusion A correctly mutated human proinsulin cDNA was obtained successfully, transfected and expressed efficiently in non- beta cells, lending support to the study of s omatic gene therapy in diabetes mellitus.     

人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人CD17分子的编码序列，将其重组人真核表达载体，并表达于COS－7细胞，方法：从活化的T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD137的编码序列，对其序列进行测定。将测定正确的CD137编码序列克隆入真核表达载体PCI－neo，构建重组表达载体。采用质体法转染COS－7细胞，用流式细胞仪检测CD137分子的表达。结果：PCR方法扩增出一800bp左右的基因片段，插入PCI－neo构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为人CD137编码序列，将重组子转染COS－7细胞，流式细胞仪检测显示有27．11％的细胞表达人CD137分子。结论：成功地克隆并在COS－7细胞中表达了CD137分子。