MSP扩增失败的原因分析及解决方法

DNA甲基化是一种影响基因外表达的机制 ,并与肿瘤发生有着密切的联系。DNA甲基化状态改变是致癌作用的一个关键因素 ,是肿瘤抑制基因的失活方式之一 ,它通过基因机制和基因外机制导致细胞增殖和分化的相关基因表达异常 ,造成细胞失去正常的基因调控而发生恶变形成肿瘤[1 ] 。而现在对DNA甲基化状态的检测方法不多 ,MSP是一个快速敏感的基因甲基化分析方法。它不需要合成限制性内切酶 ,不需要寻找限制性位点 ,且无假阳性结果 ,它的检测灵敏度可达 1 0 -5μg[2 ] 。但在MSP的扩增中有许多因素可导致其扩增失败 ,本文就MSP扩增失败的原…     

HLA-DRB1基因芯片与PCR-SSP分型的比较

目的：比较基因芯片和PCR-SSP用于汉族南方人群HLA-DRB1基因分型的结果，评价分型芯片的准确性。方法：77份待分型样本，分别用等位基因特异的PCR-SSP和基因分型芯片对DRB1分型。芯片分型通过组间特异引物扩增基因组DNA，扩增用荧光标记。扩增标记后的产物与分型芯片的探针杂交，通过杂交产生的荧光信号确定样品的HLA-DRB1基因亚型，比较两种方法分型所获得的结果，不吻合的样本全部经第三方验证或测序。结果：77份样本，两种方法分型全部成功。分型结果的吻合率为93％。不吻合样本6份，其中SSP定型纯合子4份，芯片分型全部为杂合子。经第三方验证，证实芯片对纯合子和杂合子的分型全部正确。另外2份不吻合的样本经测序，证实SSP分型错误1份，芯片分型错误1份。芯片的重复率为96％。结论：基因芯片是一种理想的分型方法，具有特异性高、重复性好、操作简便、所需样本量少、一次可作多份样本的优点。     

环介导等温扩增技术的研究进展和微生物检测应用

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。本文概述其反应原理、技术特点、相关技术、微生物检测应用及发展前景。     

如何提高PCR检测的准确率

PCR是近年来发展起来的一种快速的特定DNA片断体外扩增的一种方法。广泛应用于传染病、遗传性疾病和血液病等。具有特异性强、灵敏度高、简便快速、样品取材范围广等特点。但是．由于PCR强大的扩增能力与检测的敏感性．极微量的污染即可导致假阳性、假阴性的产生。如何在检测中避免污染，提高实验的准确率呢?根据我室多年的实践，总结了几点     

金银花nrDNA ITS区聚合酶链反应条件的研究

目的:金银花nrDNA ITS区序列G C含量为68%,用常规的PCR方法扩增效果差.本研究通过改变扩增程序及使用改性剂的方法显著提高了金银花nrDNA ITS区的扩增效率.方法:分别从金银花叶及药材中提取总DNA,通过优化扩增条件,对nrDNA ITS区进行扩增,并比较了两种优化方法的差别及适应性.方法1:提高变性温度至97℃;方法2:添加混合改性剂(DMSO 4%-甘油10%).结果:与方法1相比,方法2可降低变性温度5 ℃,升高退火温度9 ℃,降低镁离子浓度至0.5 mmol/L,降低Taq DNA聚合酶用量至0.1 U(30 μl体系),PCR产物量显著提高,且可消除植物DNA粗提物中杂质的干扰.结论:通过提高退火温度及添加改性剂可克服高G C含量金银花nrDNA ITS区序列扩增的困难,该方法的建立有助于解决植物来源DNA模板的PCR扩增问题.     

几种常用PCR扩增试剂盒检验血样DNA的结果比较

目的探讨Profiler PlusTM、IdentifilerTM与Powerplex 16HS3种试剂盒对检验血样DNA的结果,探讨3种方法的扩增不平衡和/或基因丢失现象发生机率。方法选取600名无血缘关系的中国汉族个体为研究对象,采其血样,先用其中2种试剂盒对600份血样进行DNA检验,选出出现不同检验结果的标本,再分别用3种试剂盒对以上具有不同结果的同一样本进行检验,比较检验结果,观察3种试剂盒扩增不平衡和/或基因丢失现象的发生机率。结果 600份血液样本的检验差异率为1.333%;用3种试剂盒分别对以上8份样本进行DNA检验,等位基因缺失发生率均为0.1667%;Profiler PlusTM、IdentifilerTM与Powerplex 16HS3种试剂盒的扩增不平衡的发生率分别为1.167%、0.1667%和0.1667%。结论 3种试剂盒在检验血样DNA时均会出现等位基因缺失和扩增不平衡现象,等位基因缺失的发生率之间无统计学差异,但Profiler PlusTM试剂盒扩增不平衡的发生率较另外2种较高,具有统计学差异。在实际工作中,在使用一种主要试剂盒的同时,还应注意备用其他试剂盒作为相互验证之用,减少因等位基因缺失和扩增不平衡带来的误差。     

不同PCR扩增试剂盒检验血样DNA的检验结果对比研究

目的:讨论研究Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16扩增试剂盒用于检验血样DNA检验结果的差异,并研究其扩张不平衡和基因丢失现象的发生几率。方法:选取150例完全无血缘关系的个体作为研究对象并采集其血样,分别使用两种扩增试剂盒进行检验。对所得不同结果的同一对象再使用3种扩增试剂盒进行检验。将检验所得结果进行比较。结果:3种试剂盒检测的等位基因缺失率比较差异无统计学意义(P0.05)。Profiler PlusTM检测扩张不平衡率显著高于其余两种试剂盒(P0.05)。结论:使用PCR扩增试剂盒对血样DNA进行检测时,会出现不同位置的异常基因,可表现为基因缺失及扩增不平衡。但Profiler PlusTM检验扩增不平衡发生率显著高于其余两种试剂盒。在实际生活对血样DNA进行检测时,除需准备主要检测扩增试剂盒外,还需准备其他不同类备用试剂盒用于互相验证及对比,尽量降低基因等位缺失及扩张不平衡发生率。     

环介导等温扩增技术检测福氏志贺菌的实验研究

目的：了解并建立福氏志贺菌的快速、特异的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法,探讨快速、简便、有效的消化道传播性病原体的临床诊断、饮水检测和环境卫生监测等检测手段。方法对福氏志贺菌进行细菌培养,然后使用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和LAMP技术设计4条特异性引物,以及使用克隆等分子生物学方法进行DNA提取,然后对PCR方法与LAMP方法进行对比分析。结果LAMP扩增具有非常高的特异性,几乎不会产生非特异性扩增;与PCR方法相比,LAMP检测限更低,仅为5个拷贝;LAMP在等温条件下扩增,不会因温度改变而造成时间的损失,在1h内可将靶序列扩增至109～1010倍,并且不需要模板的热变性。结论 LAMP技术具有特异敏感简单的特点,不需要特殊的仪器,在65℃时1 h即可完成反应,同时检测结果可直接通过肉眼或加入荧光染料即可判断。     

环介导等温扩增技术在脑膜炎奈瑟菌检测中的应用

目的应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种快速敏感的脑膜炎奈瑟菌属检测方法。方法对脑膜炎奈瑟菌种属基因(ctr A)序列的6个区域设计4条LAMP引物(2条内引物、2条外引物),同时设计2条环引物,并对反应条件和反应体系进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性,并与PCR检测方法进行比较。结果适宜反应条件所设计引物对脑膜炎奈瑟菌采用LAMP扩增技术,其特异性及敏感性均高于PCR检测。结论本实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测脑膜炎奈瑟菌。相比普通PCR更快速,在60 min内即可完成扩增反应,扩增效率高,反应不需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器,对操作人员的熟练度和专业水平要求不高,适合基层检验部门及小型实验室与现场监测等使用。     

两种HBV全基因组克隆方法的比较

目的通过比较血清HBVDNA水平对一片段PCR法和两片段PCR法这两种不同方法的HBV全基因组克隆效率的影响,选择出合适的HBV全基因组克隆技术,供后续的HBV的基础和临床研究。方法采集了乙型肝炎患者85份血清,分别用本研究建立的一片段PCR法及两片段PCR法扩增HBV全基因组,经双酶切鉴定后将PCR产物克隆入载体,进行HBV全基因组序列测定。同时用实时荧光定量PCR法检测上述85份血清的HBVDNA滴度。结果本研究建立的一片段法扩增成功需要的血清HBVDNA浓度高于二片段法,两种方法扩增的效率比较为一片段方法扩增的成功率低于二片段方法(P<0.05)。一片段方法的保真性:核苷酸的人为突变率为1.13bp/kb。灵敏度:为102个初始模板,大于103的重组质粒DNA80%可以成功扩增,浓度低于该值的扩增效率比较低。结论血清HBVDNA水平对两种扩增方法的成功率有一定影响,滴度高低是选择合适PCR扩增方法的依据。HBVDNA滴度大于103copies/ml的样本,可选用一片段PCR法的全基因组扩增、克隆技术,而对HBVDNA滴度小于103copies/ml样本,则可选用两片段法的全基因组扩增、克隆技术。本研究建立的一片段PCR法扩增HBV全基因组克隆的技术是一种值得推荐的好方法,但需进一步优化。     

环介导恒温扩增技术快速检测大肠杆菌O157特异基因的建立

目的 建立环介导的恒温扩增快速检测大肠杆菌O157的方法。方法 采用环介导的恒温扩增反应（LAMP）技术扩增大肠杆菌O157特异性基因,并与传统PCR比较。结果与传统的PCR技术相比,LAMP法更加简便快速、且在等温条件下进行,具有更高的灵敏性;特异性100%。结论 该方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备、为临床检测大肠杆菌O157提供了一个快速简便的新方法。     

几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较

目的：使人们在提取土壤总DNA时,可以根据不同的要求选用不同的方法。方法：选用了5种现在较常用的土壤微生物总DNA提取方法从水稻田土壤中提取总DNA,并对5种方法提取的DNA的质量和数量进行比较评价。结果：5种方法都可以从土壤中提取到长度大于48kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产量存在明显差异。土壤总DNA都不需要纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16SrDNA基因的引物可以扩增得到相应的片段。结论：Bourrain法和Martin-Laurent法可以较快地提取出DNA,Martin-Laurent法提取的DNA的量最多,Tiedje法和Janssen法提取的DNA片段最大,Janssen法提取的DNA纯度最高,Reddy法提取的DNA的完整性和PCR扩增效果最好。     

RAPD的建立及优化研究

目的：建立优化的RAPD反应条件,为进一步进行遗传监控研究奠定基础。方法：按常规方法制备小鼠基因组DNA,在一定的RAPD－PCR反应条件下分别改变各组份浓度及退火温度。扩增产物在含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶中电泳,紫外透射仪上观察照相。结果：当Mg^2 浓度为1．5mmol/L,4种dNTPs各为150μmol/L,Taq酶为1．5U,引物为0．2mol/L,模板DNA为50ng,退火温度为38℃,RAPD－PCR扩增效果好。结论：在优化的条件下规范操作,RAPD的稳定性、重复性好。     

改良一步法制备人外周血白细胞线粒体DNA

目的建立从少量外周血中提取白细胞线粒体DNA(mtDNA)的快速、简便方法.方法 58份抗凝血静置后取白细胞层,采用碱变性法裂解细胞,酚/氯仿/异戊醇抽提,RNA酶消化后再抽提及沉淀,PCR扩增产物电泳鉴定.结果获得的mtDNA样品不存在蛋白质等污染,用特异性mtDNA PCR引物从58例核酸样品中均能扩增出1 528bp的mtDNA基因片段.结论改良一步法是一种省时、经济、实用、重复性好、能满足常规分子生物学和遗传学分析需要的mtDNA制备新方法.     

恒温扩增技术在分子诊断中的应用

聚合酶链反应(PCR)技术是近年来广泛应用于科学研究和临床检验的一项技术。目前传统的PCR技术中核酸的扩增存在效率不高且需要专用的仪器设备等缺陷,而恒温扩增技术由于引物种类多样,检测方法多变,从而克服了传统PCR核酸扩增技术的缺点,使其越来越多地被应用于分子诊断中。经国内外学者的研究证实,恒温扩增技术有着广泛的应用前景,现着重对恒温扩增技术予以综述。     

HVP-18、HCMV及HSV多重PCR检测模板的建立方法及应用效果

目的探讨HVP-18、HCMV及HSV多重PCR检测模板的建立方法及应用效果。方法依据HVP-18、HCMV及HSV特异性非编码区保守序列设计三对引物,采用RT-PCR技术对引物进行特异性扩增,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及扩增条件的优化,建立含有三种引物序列的检测模板。结果含有多重引物的检测模板PCR反应体系可同时扩增出HVP-18、HCMV及HSV片段,灵敏度及特异度检测发现其能够对HVP-18、HCMV及HSV基因片段特异性扩增,分别扩增出182bp、206 bp、101 bp目的片段。结论采用多重PCR扩增技术能够建立具有高灵敏度及特异度的HVP-18、HCMV及HSV多重PCR检测模板,满足临床检测需要。     

同时检测四种病原菌的PCR方法分析

目的本文主要是讨论同时检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌的四种在食物感染常见的病原菌的快速PCR检测方法。方法选取我中心从2010年3月-2011年3月检验科收集的病原样本共60例作为研究对象。其中包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌。采用多重PCR检测方法进行检验。结果将需要检测的4中病原菌加入需扩增浓度混合液中,并且加入PCR扩增体系中进行PCR扩增。结果显示没有出现有扩征带,并且4种病原菌均出现其特异性扩增带,说明4种病原菌之间没有相互干扰,而且没有出现假阳性结果。结论多重PCR病原菌检测方法能准确检出金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌等四种常见的肠道病原,值得在卫生应急食物中毒事故处理中推广使用。     

三基因PCR检测志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的研究

目的探索一种快速、经济、敏感的诊断方法,对常见的食品中的腹泻致病菌进行基因检测研究。方法建立一种快速标本处理和多基因PCR反应(multiplePCR)诊断方法,在一次PCR反应中同时扩增3种菌的致病基因:志贺菌的侵袭性(ipaH)基因、副溶血弧菌的热稳定直接溶血素(tdh)基因和霍乱弧菌Ο139的霍乱毒素(ctx)基因。扩增产物经电泳,出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为阳性标本;另外对这些标准菌株进行Southernblot杂交鉴定。结果对标准志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测,多基因PCR法检测为阳性;PCR作为诊断方法较培养法阳性率高。结论三基因PCR具有简便、快速、特异、经济和不需要培养等特点,适用于食品检测。     

双重PCR检测沙门氏菌和变形杆菌方法的建立

目的:建立快速鉴定腹泻患者粪便标本中和变形杆菌的双重聚合酶链式反应（PCR）方法。方法:针对沙门氏菌属特异基因invA和变形杆菌属特异基因tuf分别设计特异性引物,2013年5月-10月天津某医院肠道门诊腹泻患者粪便标本经SS培养基分离培养后,对可疑菌株同时进行invA-tuf基因双重PCR鉴定和生化鉴定,比较两种方法结果的一致性;对沙门氏菌进一步行血清学分型。结果:双重PCR和生化反应都各自鉴定得到沙门氏菌31株和变形杆菌62株,而且二者鉴定结果完全一致;31株沙门氏菌包括鼠伤寒、肠炎等常见血清型和格兰扁、菲尔摩雷等罕见血清型,均能扩增出283 bp长度片段,62株变形杆菌包括48株奇异变形杆菌、8株普通变形杆菌、2株潘氏变形杆菌、4株产黏液变形杆菌,均能扩增出541bp长度片段。 结论:invA-tuf基因双重PCR方法能够快速可靠地鉴定SS培养基上生长的沙门氏菌和变形杆菌。     

线粒体直接PCR扩增法

为建立一种不需提取线粒体DNA而直接用线粒体进行聚合酶链反应 (PCR)的方法 ,将得到的线粒体用高温加热 ,使线粒体膜破裂 ,释放DNA后 ,直接用于PCR扩增。结果 :扩增产物与提纯的线粒体DNA扩增得到的产物一样丰富。提示 :该方法适用于对线粒体DNA纯度没有特别要求的试验