苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

反式二羟环氧苯并(a)芘所致人支气管上皮细胞POLK基因高表达

目的观察不同剂量反式二羟环氧苯并(a)芘(anti-BPDE)处理对人支气管上皮细胞(16HBE)POLK基因表达的影响。方法分别以0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的反式-BPDE1次或3次处理16HBE细胞,采用TaqmanMGB探针实时定量聚合酶链反应方法相对定量POLK和POLZ基因表达,同时对反式-BPDE转化的16HBE及肺癌H1299细胞POLK基因表达进行了分析。结果反式-BPDE1次处理及3次处理可诱导正常16HBEPOLK基因高表达。反式-BPDE转化16HBE和肺癌H1299细胞POLK基因表达明显增高,分别是正常16HBE的2.25和5.49倍。结论反式-BPDE处理可致16HBEPOLK基因高表达。     

反式二羟环氧苯并(a)芘-DNA加合物在肺癌发病中的作用

[目的]反式二羟环氧苯并 (a)芘 (BPDE)为苯并 (a)芘在体内的代谢产物 ,是一种直接的致癌物 ,可攻击DNA形成BPDE_DNA加合物 ,本研究目的为探明该加合物在人群肺癌发生中的作用及其分子机制。[方法]使用针对BPDE_DNA加合物的单克隆抗体 ,通过免疫学方法检测150例肺癌、120例癌旁肺组织、40例肺良性病变和40例正常肺组织中BPDE_DNA加合物的含量 ,同时检测相应肺组织中P53、C_MYC、K_ras、BCL_2、hTERT等癌变相关基因的表达 ,分析BPDE_DNA加合物与上述基因的关系。并在BPDE诱导的体外人气管上皮细胞癌变模型上检测癌变过程中BPDE_DNA加合物的变化。[结果]82.0 % (123/150)的肺癌组织 ,37.5 % (45/120)的癌旁肺组织 ,15.0% (6/40)的肺良性病变和2.5% (1/40)的正常肺组织可检出BPDE_DNA加合物 ,肺癌组织中加合物的含量显著高于其他肺组织 ,P<0.01。分层分析发现男性肺癌病例加合物检出率为89.9% (107/119)高于女性的检出率51.6 % (16/31) ,P<0.05。有吸烟史的肺癌患者加合物检出率为99.1% (113/114)高于非吸烟肺癌患者的27.8% (10/36),P<0.01。肺癌组织P53、K_ras、BCL_2基因的阳性表达与BPDE_DNA加合物有关联 ,而C_MYC、hTERT基因的表达与BPDE_DNA加合物无关联。在体外用BPDE作用于人气管上皮细胞系 ,可诱导     

苯并（a）芘作用下人支气管上皮细胞蛋白表达谱的改变

[目的]观察苯并（a）芘（BaP）作用下人支气管上皮细胞（16HBE）蛋白表达谱的改变。[方法]以0、1、2、4、8、16、32、64um01／L的BaP染毒细胞24h,应用双向凝胶电泳和ImageMaster软件分析BaP处理后细胞内蛋白质表达谱的改变,基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF）结合数据库检索鉴定差异表达蛋白质斑点。[结果]各浓度染毒组与对照组相比,成功鉴定了17个差异表达蛋白质斑点,其中表达上调的有9种,下调的有8种。这些蛋白质包括细胞骨架蛋白、与能量代谢有关的蛋白、与DNA损伤修复有关的蛋白、肿瘤标志物、伴侣蛋白、与信号转导有关的蛋白和与氧化应激有关的蛋白。[结论]BaP作用于16HBE后导致与细胞损伤、DNA修复、应激、细胞恶性转化等有关的蛋白质表达发生改变。     

二羟环氧苯并芘恶性转化细胞的microRNA表达谱

目的 检测二羟环氧苯并芘(BPDE)恶性转化细胞的microRNA(miRNA)表达谱,寻找恶性转化细胞与对照细胞差异表达的miRNA.方法 以溶剂二甲亚砜助溶的终浓度为2.0 μmol/L的BPDE培养液培养人支气管上皮细胞株16HBE,获得BPDE恶性转化的细胞模型为实验组,同时,以含二甲亚砜的培养液培养正常16HBE作为对照组.通过微阵列技术检测实验组与对照组327个人类miRNA,并选择差异表达明显的miR-10a和miR-320用反转录荧光定量PCR方法对微阵列结果加以验证.结果 获得2组细胞327个miRNA表达谱,发现差异表达miRNA 55个,其中46个表达上调,9个表达下调,并得到反转录荧光定量PCR的验证.结论 获得BPDE恶性转化细胞与正常16HBE细胞差异表达的miRNA,为进一步寻找BPDE恶性转化细胞特征性miRNA提供了研究基础.     

不同代谢活化系统增强苯并(a)芘诱导人支气管上皮细胞转化效应

目的探讨不同的代谢活化系统在苯并(a)芘[B(a)P]诱导人细胞转化模型中的应用。方法选择人支气管上皮细胞HBETR,采用3种不同的代谢活化方式:分别为加入大鼠S9组分(S9-Mix)、高表达代谢关键酶P450CYP1A1(HBETR-1A1细胞)和染毒前48小时用低剂量B(a)P诱导(HBETR-IN细胞)。通过软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验来比较在不同的代谢活化系统下,间接致癌物B(a)P诱导细胞转化的效能。结果通过蛋白印迹和酶活性检测结果验证HBETR-1A1细胞构建成功。细胞的生物学特性没有明显的改变。20μmol/LB(a)P染毒作用下HBETR-1A1、HBETR-IN细胞出现转化时间均为11周,而未加入活化系统时,HBETR细胞需14周才能获得恶性转化。HBETR细胞在加入和不加入S9-Mix的条件下,转化时间分别是14周、20周。上述转化的效果与CYP1A1酶活性以及蛋白表达水平相一致。结论三种代谢系统都能够促进间接致癌物B(a)P的代谢活化,缩短细胞的转化间期,提高细胞转化效率。从试验操作难度、试验的重复性及结果的可靠性等几个方面比较三种代谢系统应用的可行性,低剂量诱导作为新的代谢活化的方法在细胞转化试验中有着潜在的应用前景。     

雌二醇对苯并(a)芘致雄性小鼠肺癌抑制作用

目的 建立苯并(a)芘[B(a)P]诱发雄性昆明小鼠肺癌的动物模型,探讨雌二醇(E2)在该模型中对B(a)P致肺癌作用的影响.方法 将不同组的雄性昆明小鼠分别给予B(a)P、E2干预,每周1次,持续8周,恢复8周后处死,进行形态学观察和病理学诊断,并检测血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平.结果 B(a)P组小鼠的肺癌发病率和肿瘤数分别为36.0%和1.154±0.54,明显高于对照组和E2组(P<0.05);B(a)P+E2组小鼠的肺癌发病率和肿瘤数分别为32.0%和0.88±0.33,明显高于对照组和E2组(P<0.05);B(a)P组小鼠的肺癌发病率和肿瘤数高于B(a)P+E2组,肿瘤数差异有统计学意义(P<0.05),而发病率差异无统计学意义(P>0.05).血清MDA水平以B(a)P组最高,B(a)P+E2组及E2组次之,对照组最低;SOD与MDA的趋势相反.结论 建立了灌胃B(a)P诱发雄性昆明小鼠肺癌的动物模型,E2可能通过抗氧化作用减少B(a)P诱发的肺癌肿瘤数.     

苯并(a)芘对小鼠肝细胞凋亡的影响

目的探讨苯并（a）芘（BaP）对小鼠肝细胞Fas／Fas—L凋亡信号通路的影响。方法ICR小鼠灌胃染毒，染毒剂量分别为0，5，10，20，40mg／kg，采用免疫组织化学法检测肝细胞Fas、Fas—L、caspase-3基因表达情况，应用吖啶橙／溴化乙啶（AO／EB）荧光双染法检测肝细胞凋亡情况。结果BaP各剂量染毒组肝细胞凋亡发生率及Fas、Fas—L、caspase-3基因表达阳性率与对照组比较差异均有统计学意义（P〈O．05）。结论BaP可诱发小鼠肝细胞发生凋亡。Fas／Fas—L信号通路改变是引起肝细胞凋亡发生的重要途径之一。     

牛磺酸对苯并(a)芘致L-02细胞损伤保护作用

目的 研究牛磺酸对苯并(a)芘(B(a)P)致人胚肝细胞(L-02细胞)染色体损伤的保护作用.方法 以L-02细胞为靶细胞,按完全随机设计分成5组:(1)空白对照组;(2)溶剂对照组;(3)B(a)P染毒组:设12.5,25,50μmol/L3个剂量染毒细胞;(4)牛磺酸组:设1.0,2.0,4.0mmol/L3个浓度,加入培养体系后继续培养24h;(5)牛磺酸预防组:L-02细胞先以3个不同浓度的牛磺酸预处理24h,再加入25μmol/L的B(a)P培养24h.各组均设3个平行样.收获细胞后用微核实验检测染色体损伤,计算微核率和核分裂指数.结果 牛磺酸单独作用于L-02细胞时,与空白对照组比较,中、高浓度牛磺酸诱导的微核率降低,核分裂指数增高,差异有统计学意义.从低到高3个剂量B(a)P单独染毒L-02细胞诱导的微核率为(34.67±2.52),(45.33±4.16),(60.00±7.21)%.核分裂指数分别为1.326±0.034,1.228±0.006,1.148±0.012,与溶剂对照组比较微核率升高,核分裂指数降低,差异有统计学意义,且两者均呈明显的剂量-反应关系.低、中、高浓度牛磺酸预防组诱导的微核率对应为(30.33±3.51),(25.67±1.53)和(23.00±1.00)%.均比单纯25μmol/LB(a)P染毒组诱导的微核率降低,差异有统计学意义.低、中、高浓度牛磺酸预防组对应的核分裂指数为1.455±0.011,1.474±0.015和1.1492±0.013,比单纯25μmol/LB(a)P染毒诱导的核分裂指数高,差异有统计学意义,且两者均呈剂量-反应关系.结论 B(a)P能诱导肝细胞染色体损伤,且存在明显的剂量-反应关系;牛磺酸预处理对B(a)P引起的肝细胞毒性具有明显保护作用.     

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。     

基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因

目的 采用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘（BPDE）转化的人支气管上皮细胞（16HBE）相关基因，探讨该技术在分子毒理学研究中的应用。方法 将实验组（BPDE-16HBE）和对照组（16HBE）的mRNA逆转录合成cDNA掺入荧光分子为探针，杂交于H40S基因芯片。分析2组基因的差异表达。结果 在4096种人类基因中。BPDE转化的16HBE和正常16HBE问存在差异表达的基因有143条，其中高表达52条，低表达41条。结论 基因芯片技术在筛选BPDE转化的16HBE相关基因改变上，具有高通量、高敏感、快速等特点，在毒物的分子致癌机制研究中意义萤大．     

反式BPDE诱发的转化细胞与成瘤细胞FHIT基因变化研究

目的:探讨苯并(a)芘[B(a)P]代谢产物反式二氢二醇环氧苯并芘[anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE]引起的细胞FHIT基因突变情况。方法:PCR、RT-PCR、多聚酶链聚合反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)。结果:PCR-SSCP结果提示反式BPDE诱发的恶性转化细胞及其裸鼠成瘤细胞FHIT基因的Exon1-9出现了异常的小片断。结论:反式BPDE可作用于细胞染色体3p14.2的脆性部位FRA3B,引起FHIT基因的重排或缺失,导致FHIT基因功能失活。推测FHIT基因可能是反式BPDE致癌作用的靶分子之一。     

烟草致癌物诱发人支气管上皮恶性转化细胞中p16基因的变化

采用银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法检测ＮＮＫ诱发ＢＥＰ２Ｄ恶性转化细胞中ｐ１６基因变化。与对照组比较,转化细胞中ｐ１６基因的Ｅ１．β外显子带型出现变异,而第１～３外显子均未见泳动变位,提示Ｅ１．β外显子突变和／或缺失所致细胞周期失调是ＮＮＫ诱发人类支气管上皮细胞癌变的可能原因之一。     

致癌物诱导恶变细胞中线粒体高变区序列分析

目的检测苯并（a）芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘（反式-BPDE）及结晶型硫化镍（NiS）诱发永生化人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化过程中线粒体DNA控制区序列变化。探讨线粒体DNA控制区在环境致癌物苯并（a）芘及硫化镍致癌作用中是否存在靶分子序列。方法 应用银染PCR-单链构向多态性（SSCP）方法及测序方法分析恶变细胞中线粒体DNA高变区的序列变化。结果 经反式-BPDE和NiS诱导恶变的人支气管上皮细胞系线粒体高变区均未发现异常改变。结论 线粒体基因控制区可能并非是化学致癌物诱发肺癌的靶序列。     

硫化镍转化人细胞翻译启动因子的异常表达

目的探讨结晶型硫化镍(NiS)在诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶变过程中蛋白质翻译启动因子(TIF3)的异常表达，以阐明不容性硫化镍的人类分子致癌机制。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，以及敏感先进的荧光定量PCR方法，对异常表达的蛋白质翻译启动因子TIF进行检测。结果相对于非转化对照细胞，RT-PCR实验初步显示，这些镍转化细胞和成瘤细胞的TIF3基因表达水平显著升高，平均分别是对照细胞的2和4倍，表明TIF3的异常表达水平与硫化镍诱发人支气管上皮细胞的恶变程度有关。结论不容性结晶型硫化镍在诱发人支气管上皮细胞恶变过程中，存在明显的蛋白质翻译启动因子TIF3异常表达现象，其表达水平与细胞的恶变程度密切相关，可能是结晶型硫化镍诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一。     

硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究

目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.     

反式—BPDE诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变的研究

目的 检测苯并（a）芘的代谢产物反式－BPDE诱发的人支气管上皮细胞系P53基因突变,探讨苯并（a）芘在人肺癌发生中的作用。方法 用银染PCR－SSCP方法检测P53抑癌基因第5、6、7、8外显子的突变情况。结果 经反式－BPDE处理的人支气管上皮细胞系,20d,后P53基因第8外显子出现点突变。结论 结果提示,P53基因突变可能是苯并(a)芘诱发肺癌的早期分子事件。     

镉对16HBE细胞凋亡及Bal-2、Bax基因表达影响

目的探讨镉恶性转化人支气管上皮细胞(16HBE细胞)过程中细胞凋亡状况以及Bal-2和Bax表达变化。方法采用流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE 细胞不同阶段(第5、15、35 代细胞及成瘤细胞)的细胞凋亡和 Bal-2和Bax基因mRNA表达情况。结果16HBE细胞和恶性转化细胞系第5、15、35 代细胞及成瘤细胞的凋亡率分别为0.65%、1.14%、1.87%、3.78%和4.93%;细胞的Bal-2和Bax的mRNA表达量分别为(9.067±0.155)、(8.183 ±0.206)、(5.971±0.015)、(4.533±0.030)、(4.863±0.066)和(5.973±0.026)、(6.012±0.112)、(6.659±0.028)、(7.032±0.045)、(7.519±0.022),随着转化代数增加,Bal-2 mRNA表达量逐渐降低,Bax的mRNA表达量逐渐上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中能引起细胞凋亡,抑止Bal-2基因的表达和上调Bax基因表达。