一种优化的适用于双向电泳的水稻纹枯病菌蛋白质提取方法

为开展水稻纹枯病菌蛋白质组学的研究,采用TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法对水稻纹枯病菌蛋白质提取质量进行比较,并建立了双向电泳体系。对电泳后的图谱用Quantity One软件进行分析,结果发现:TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法所获得的蛋白质双向电泳图谱中,分别记录得到557、309和877个蛋白质点。SDS法提取的蛋白质样品杂质较多,存在盐离子和小分子物质干扰,得到的蛋白点较少;TCA-丙酮法提取的蛋白质样品呈黄色,有色素残留;而在TCA-丙酮法的基础上,增加酚/SDS抽提步骤,能够有效地去除样品中的盐离子和色素等杂质,获得背景清晰、分辨率高的蛋白图谱。结果表明,本研究建立了一种优化的TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法,该法适用于水稻纹枯病菌蛋白质双向电泳的提取。     

潮间带大型海藻小珊瑚藻蛋白质提取方法及双向电泳体系优化

为建立适用于潮间带大型海藻小珊瑚藻(Corallina pilulifera)蛋白质组学分析的样品制备方法,分别用饱和酚抽提法、三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法、Trizol提取蛋白法、Biozol提取蛋白法、饱和硫酸铵沉淀法对蛋白质进行提取,筛选出小珊瑚藻蛋白质提取的最优方法,并从胶条pH值和分离胶浓度探究双向电泳系统的优化条件。结果表明,在胶条pH值为4～7和分离胶浓度为12.5%条件下,并使用饱和酚抽提法提取蛋白质,所提取蛋白质不仅浓度高且纯度较高,因而可获得稳定清晰、蛋白质点数较多的双向电泳图谱。该体系可为红藻门大型海藻的蛋白质组学分析提供重要的技术参考。     

果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立

以果梅花芽为材料,比较了TCA/丙酮法和酚抽法2种总蛋白质提取方法对蛋白质双向电泳(2-DE)的影响,同时对IPG胶条种类、凝胶浓度、蛋白质上样量及染色方法等环节进行了优化.结果表明:TCA/丙酮法比酚抽法在2-DE凝胶图谱上的蛋白质点数增多,图谱背景也比较清晰,没有明显的纵横条纹;采用17 cm pH 4～7的胶条、10％的凝胶浓度、1.5～1.8 mg的蛋白质上样量,经改良胶条考马斯亮蓝G-250染色后可获得背景清晰、重复性好、蛋白质分辨率高的2-DE图谱.高质量的果梅花芽蛋白质提取方法和蛋白质双向电泳体系的优化可为果梅蛋白质组学研究奠定技术基础.     

山定子(Malus baccata Borkh.)根系蛋白质提取及双向电泳技术体系的建立

为开展山定子(Malus baccata Borkh.)根系蛋白质组学研究,以当年生15片真叶的山定子实生苗白色幼嫩根系为试材,采用TCA-丙酮沉淀法、酚抽提法和Trizol抽提法3种方法提取其总蛋白质,并对样品上样量、IPG胶条的p H值范围和等电聚焦参数进行优化,建立适用于山定子根系的双向电泳技术体系。结果表明:采用Trizol抽提法提取的蛋白质产率最高,可达3.15mg·g-1FW,且其SDS-PAGE图谱明显优于其他两种方法 ;选用800μg的上样量,17 cm p H值4~7的IPG胶条和改进后的等电聚焦程序所得到的二维电泳图谱蛋白点最多,最清晰,分辨率最高。     

青杨双向电泳实验体系的建立

用改良丙酮沉淀法、三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法和酚抽法抽提青杨Populuscathayana的蛋白质,分别获得了437,603和721个蛋白斑点,以酚抽法提取的分离纯化方法效果最佳,不仅能很好地提取蛋白,而且能有效去除样品中的盐分。通过比较,分析了双向电泳不同条件对电泳结果的影响,确立了300μg·IPG胶条^-1的最佳上样量、90000V·h的聚焦时间以及20min平衡时间的双向电泳条件。研究还比较了氯化钠胁迫前后双向电泳图谱差异,发现有46个蛋白点存在差异,其中10个下调,36个上调（4个新诱导表达）。     

百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立

以‘蓝色大花’百子莲(Agapanthus praecoxssp.orientalis‘Big blue’)茎尖分生组织为材料,对比研究了不同提取与裂解方法制备蛋白样品以排除多酚、多糖及核酸物质对蛋白双向电泳体系(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)的干扰。提取过程采用TCA/丙酮沉淀法和超声波破碎法;蛋白裂解过程中分别使用苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride,PMSF)和乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)、Cocktail(广谱性)蛋白酶抑制剂、核酸酶Nuclease Mix和2-D Clean-Up蛋白纯化试剂盒。制备的各蛋白样品经过7cm IPG(pH 3~10)胶条上样、电泳后发现,使用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白,裂解液中加入Cocktail蛋白酶抑制剂裂解后,用2-D Clean-Up试剂盒所制备的样品其双向凝胶电泳图谱效果最好,获得蛋白点数量最多,且蛋白等电点pI主要分布于4~8之间。随后,应用分辨率更高的24cm IPG(pH 4~7)胶条进行电泳效果的验证,蛋白点在凝胶的2个方向上均得到了较好地分离,经过ImageMaster 2-D Platinum5.0软件分析后共检测到有效蛋白点820个。本研究初步建立了百子莲茎尖分生组织蛋白双向凝胶电泳体系,为后续开展百子莲属植物蛋白质组学研究提供了重要的技术保障。     

不同pH梯度的IPG胶条对绿竹叶片蛋白双向电泳的比较

双向电泳(2-DE)技术是研究蛋白组学的有效途径和重要手段,而在双向电泳第一向中使用不同pH梯度的IPG胶条,是对双向电泳技术研究的深入。利用改良的TCA/丙酮与Tris-饱和酚提取法,提取纯度更高的绿竹叶片全蛋白,并在双向电泳中使用不同pH梯度的IPG胶条,检测其对绿竹叶片双向电泳图谱的影响。结果表明,蛋白样品上样量为20μg时,在7 cm的pH3-10L、pH3-10NL、pH5-8L 3种胶条中,pH5-8L的胶条在双向电泳的凝胶图谱上显现的蛋白点数目最多,约有400个,而且蛋白点的分布较其他2个胶条的结果更为均匀,清晰度更高;pH3-10NL的胶条的图谱上显现的蛋白点要比同一跨度的pH3-10L的胶条更多;通过3种胶条的对比可以使绿竹叶片双向电泳的分辨率显著提高。对于在pH5-8L显现出来的4个蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱分析,成功鉴定出4个蛋白点,其中3个蛋白点在pH3-10L胶条的双向电泳中是没有显现出来的,这些蛋白对于植物生物功能的发挥具有意义。试验表明了对于一些低丰度蛋白及小分子量蛋白的检测和鉴定,可以利用pH梯度较小的固化胶条进行双向电泳试验。     

利用双向电泳技术分离节瓜叶片总蛋白的方法研究

【目的】建立适合节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系.【方法】以节瓜品种"A37毛节瓜"为材料,对蛋白质抽提方法、上样量、凝胶浓度及IPG胶条pH范围等关键因素进行探索与优化.【结果和结论】与TCA/丙酮沉淀法及酚提取法相比,改良酚提取法抽提蛋白质总量较高,纯度最高,SDS-PAGE电泳条带明显、清晰,双向电泳图谱蛋白质点最多、清晰均匀、纵横条纹少.利用17 cm pH 4~7范围IPG胶条、120μg蛋白质上样量、12%凝胶浓度,硝酸银染色获得蛋白质点数丰富、分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,检测到节瓜叶片蛋白质点1 936个,相对分子质量主要分布于15 000~100 000之间.初步建立了一套适用于节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系,为后续开展蛋白质组学研究及其相关工作奠定了基础.     

小麦籽粒蛋白质双向电泳体系的优化

为建立一套适合于小麦籽粒蛋白质双向电泳的技术体系,以青海省农林科学院自育春小麦品种青春38籽粒为材料,对比了2种在植物组织中常用的蛋白质提取方法,对双向电泳过程中胶条p H值、蛋白质上样量和分离胶浓度等方面进行了优化。结果表明:与用酚提取法相比采用TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白质所得的双向电泳图谱质量较好,蛋白质经裂解后在17 cm、p H 5~8的IPG胶条、上样量380μg和分离胶浓度12%的条件下得到了清晰、蛋白质点丰富的双向电泳图谱。     

利用双向电泳技术分离野牛草叶片蛋白的方法研究

制备野牛草叶片蛋白质样品,对双向电泳条件等技术环节进行优化,以期获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱,建立适应野牛草叶片蛋白组学研究的技术平台,并对其蛋白组进行初步分析。采用TCA/acetone沉淀法和Trizol沉淀法分别提取野牛草叶片蛋白,通过不同聚焦时间分离,最终经硝酸银染色,以Imagemaster 2D Platinum V 5.0图像分析软件对所得的双向电泳图谱进行分析比较。对获得的最佳图谱进行蛋白点分布分析,选择最适合的胶条pH值。结果表明:Trizol沉淀法提取蛋白样品,总聚焦伏时数在8~10万V.h间,为最适合条件,获得图谱背景清晰,纵横纹少,蛋白点分离较完全,在pH3~10胶条凝胶可检测到的蛋白质点达到800个。对蛋白点pH分布范围分析表明,85%蛋白点分布在pH4~7之间,选择pH4~7的IPG胶条,能检测到1 000个以上的蛋白点。以Trizol沉淀法结合优化的双向电泳参数对野牛草叶蛋白组进行双向电泳分离,获得了高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱,可用于野牛草差异蛋白质组学研究。     

Combining Phytate/Ca2+ Fractionation with Trichloroacetic Acid/Acetone Precipitation Improved Separation of Low-Abundant Proteins of Wheat (Triticum aestivum L.) Leaf for Proteomic Analysis

Proteomic assessment of low-abundance leaf proteins is hindered by the large quantity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) present within plant leaf tissues. In the present study, total proteins were extracted from wheat (Triticum aestivum L.) leaves by a conventional trichloroacetic acid (TCA)/acetone method and a protocol first developed in this work. Phytate/Ca²⁺ fractionation and TCA/acetone precipitation were combined to design an improved TCA/acetone method. The extracted proteins were analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The resulting 2-DE images were compared to reveal major differences. The results showed that large quantities of Rubisco were deleted from wheat leaf proteins prepared by the improved method. As many as (758±4) protein spots were detected from 2-DE images of protein extracts obtained by the improved method, 130 more than those detected by the TCA/acetone method. Further analysis indicated that more protein spots could be detected at regions of pI 4.00–4.99 and 6.50–7.00 in the improved method-based 2-DE images. Our findings indicated that the improved method is an efficient protein preparation protocol for separating low-abundance proteins in wheat leaf tissues by 2-DE analysis. The proposed protocol is simple, fast, inexpensive and also applicable to protein preparations of other plants.     

苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

 为探索适用于苹果叶片蛋白质组学研究的样品制备方法,比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法（TCA）、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和Tris-HCl提取法等3种总蛋白质的提取方法。制备的样品经双向电泳分离采用银染显色。结果3种方法分别得到450、374和1032个蛋白质点。认为Tris-HCl提取法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大。     

橡胶树C-乳清三种蛋白提取方法双向凝胶电泳分析

摘要：C-乳清是胶乳的主要组分,就双向凝胶电泳技术而言,目前仍无有效的蛋白提取方法,这严重制约了双向凝胶电泳技术在橡胶树蛋白组分析上的应用。本文选取3种方法提取C-乳清蛋白,通过对蛋白产量和提取蛋白的双向凝胶电泳图谱分析系统评价3种方法。就蛋白产量而言,三氯乙酸/丙酮沉淀法产量最高（0.86 mg/ml C-乳清）,三氯乙酸沉淀法次之（0.72 mg/ml C-乳清）,酚提取法最低（0. 66 mg/ml C-乳清）。双向凝胶电泳图谱分析表明：酚提取法可检测到447个蛋白点,图谱背景较暗且横纵向纹理多;三氯乙酸沉淀法可检测到821个蛋白点,图谱背景居中;三氯乙酸/丙酮沉淀法可检测到1052个蛋白点,图谱背景清晰且基本无纹理。综上所述,三氯乙酸/丙酮沉淀法最适合C-乳清蛋白提取。本文首次系统评价C-乳清蛋白提取方法,必将推动橡胶树C-乳清蛋白研究发展。     

烟草根系蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适于烟草根系蛋白质组学研究的样品制备方法,以栽培品种K326生长期根系为材料,比较了常规裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol抽提法和酚法等4种总蛋白质的提取方法。对制备的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)检测。结果表明:酚法最佳,所获蛋白在单向SDS-PAGE中形成条带数目多而清晰;经双向电泳分离用银染显色,可检测约548个蛋白点,图谱分辨率较好,蛋白点清晰,主要集中在等电点pH5～8、相对分子量25.0～70.0kD,可有效解析烟草根系的蛋白质组。     

苔藓植物双向凝胶电泳蛋白样品制备的优化

比较了苔藓植物小立碗藓3种蛋白样品制备方法,结果分析表明,直接研磨法和三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法检测的蛋白点的数量相差不明显;直接研磨法提取蛋白所得到的2-DE图谱蛋白点模糊,分辨率低,横竖条纹干扰严重;三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法分离效果较好,分辨率有所提高.改良的酚抽提/乙酸铵沉淀法检测的蛋白点远远多于前两种方法,所得到的图谱质量最高,分辨率大大提升,蛋白点分布均匀清晰,横竖条纹干扰也很少,凝胶背景干净,是最佳的小立碗藓蛋白样品制备的方法.     

两种花吊丝竹叶片蛋白提取方法的2-DE比较

以2年生花吊丝竹的扦插苗为研究材料,对2种方法(TCA/酚提结合法和PEG法)提取的蛋白质的2-DE差异进行研究.结果表明:PEG法的5个组分的条带差异明显,全蛋白得到了有效分离,在F3中富集到了2条高丰度蛋白带;2种方法的2-DE图谱的均一性分析发现,PEG法中F3富集了高丰度蛋白,提高了2-DE中蛋白质的检测率和分辨率,PEG法中F1-F5共检测的蛋白总数超过了1700个,但是相邻组存在一定的重叠率,而TCA丙酮/酚提结合法只检测到约571个蛋白点,5个组与NF平均有439个蛋白点匹配,达到77.9%以上;质谱鉴定了5种差异蛋白,生物信息学分析发现这5种蛋白是糖酵解、糖异生和ATP合成的重要辅酶.2种方法的比较发现,PEG法能够将花吊丝竹叶片全蛋白中高丰度蛋白单一富集在16%的组分中,从而显著提高了2-DE的分辨率,再通过质谱技术能够检测到更多的影响生物体生长发育的低丰度蛋白,所以PEG法是一种切实可行的且较为理想的蛋白质提取方法.     

Protein Extraction Methods for Two-Dimensional Electrophoresis from Baphicacanthus cusia （Nees）Bremek Leaves-A Medicinal Plant with High Contents of Interfering Compounds

Protein extraction is a critical step for two-dimensional electrophoresis （2-DE）. Different plant samples require different and adaptive protein extraction protocols. The leaves of medicinal plant, Baphicacanthus cusia （Nees） Bremek are notoriously recalcitrant to common protein extraction methods due to high levels of interfering compounds （especially the secondary metabolites and pigments）. This study was aimed to establish a routine procedure for the proteomic analysis ofB. cusia leaves, and a new protocol for the protein extraction was developed by optimizing trichloroacetic acid （TCA）/ acetone extraction method. The efficiency of this protocol was demonstrated by comparison with 3 published protein extraction methods （chloroform/acetone, Mg/NP-40, Tris-base/acetone）. The results showed that the optimized TCA/ acetone precipitation extraction method gave a relatively high protein yield （9.263 mg g^-1 fresh weight）, high-resolution separation, clear protein profiles, the highest proteins spots （1 31 t protein spots）, and displayed less contamination in 2- DE gels. Therefore, the results suggested that the optimized TCA/acetone method was the most effective among the 4 methods for B. cusia leaves.