新冠病毒中和单克隆抗体及纳米抗体研究进展北大核心CSCD

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)引起的疾病被命名为新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19),是一种具有强传染性、高易感性、长潜伏期的传染病。病毒刺突蛋白受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)和细胞血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)之间的相互作用使得SARS-CoV-2顺利进入细胞。本文对SARS-CoV-2与ACE2的相关作用机制进行了简单概述,对目前针对SARS-CoV-2中和单克隆抗体、纳米抗体的最新研究进展进行了总结,探讨了新冠肺炎的发展过程和抗体药物的研究方向,以期为包括新冠肺炎在内的新发、突发传染病中和抗体药物的研发提供参考。     

SARS-CoV-2中和纳米抗体在里氏木霉中的重组表达北大核心CSCD

基于骆驼科动物单链抗体VHH结构域的纳米抗体具有分子量小、结构简单、溶解性好、稳定性强等多种优势,可通过吸入给药,在呼吸道病毒的防控中具有重要应用价值。里氏木霉是食品级的蛋白质生产宿主,其纤维素酶分泌量可达到80 g/L以上,有望用于药物蛋白的低成本生产。文中在密码子优化的基础上,使用组成型强启动子Pcdna1,实现了SARS-CoV-2中和纳米抗体Nb20在里氏木霉中的重组表达。将Nb20与里氏木霉纤维二糖水解酶CBHⅠ的N端片段融合表达,并在二者间引入胞内KEX2蛋白酶切位点,于葡萄糖培养基中摇瓶发酵48 h可生产出浓度为47.4 mg/L的Nb20蛋白。重组表达的纳米抗体能够与SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合区相结合,有望用于新型冠状病毒的中和。以上结果显示,里氏木霉在纳米抗体的重组表达中具有一定的应用潜力。     

原核表达系统制备HPV58L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体

目的:采用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒58型(human papillomavirus type 58,HPV58)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。方法:合成法获得HPV58 L1大肠杆菌密码子优化基因,构建HPV58 L1重组原核表达质粒mpET22b/HPV58 L1,检测其在BL21(DE3)中表达水平,饱和硫酸铵沉淀加阳离子交换层析法纯化蛋白后进行动态光散射(dynamic light scatter,DLS)分析。小鼠免疫后,检测免疫血清针对HPV58假病毒的中和抗体水平。结果:HPV58 L1蛋白在BL21(DE3)细胞中大部分以可溶形式表达,纯化获得的HPV58 L1蛋白可组装成水动力学直径约为74 nm的VLP。0.5μg的HPV58 L1 VLP可诱发小鼠产生高滴度的HPV58特异性中和抗体,可维持至少20周。结论:原核表达系统制备的HPV58 L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体,可用于成本低的HPV58疫苗的研究。     

抗HIV-1中和抗体的研究进展

自1982年美国疾病预防与控制中心(CDC)对那些与免疫缺陷和卡氏肺囊虫肺炎等症状有关的病例命名为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)以来,研究者们对预防和治疗性AIDS疫苗的研究进行了不懈的努力,实验中的疫苗包括env亚单位疫苗、减毒活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗等等,但至今尚没有一种疫苗能获得理想的免疫效果.最近研究者们对中和抗体(Neutralization antibody, nAb.)在HIV-1感染中的作用的研究结果让人们看到一些新的曙光.     

抗HIV-1中和抗体的研究进展

自1982年美国疾病预防与控制中心(CDC)对那些与免疫缺陷和卡氏肺囊虫肺炎等症状有关的病例命名为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)以来,研究者们对预防和治疗性AIDS疫苗的研究进行了不懈的努力,实验中的疫苗包括env亚单位疫苗、减毒活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗等等,但至今尚没有一种疫苗能获得理想的免疫效果。最近研究者们对中和抗体(Neutralizationantibody,nAb.)在HIV1感染中的作用的研究结果让人们看到一些新的曙光。尽管对nAb是否在预防HIV1感染过程中具有保护作用存在争议,但是仍然有不少的研究者在nAb方面展开了大量的工作,以期…     

人源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达

在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎（甲肝）病毒中和发生基因工程Fab抗体的基础上,对所获得的4株中和性Fab抗体轻重链可变区进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定。4株Fab抗体重链可变区拥有99％同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列,属于VHⅢ基因家族,而轻链可变区核苷酸序列同源性为95％和相似的CDR区氨基酸序列,属于VL5基因家族。这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝克隆抗体产生竞争抑制反应,表明其针对甲肝癌病毒结构蛋白上的主要抗的决定簇。     

中和试验和ELISA法检测育龄妇女血清麻疹抗体的比较

目的:研究中和试验和ELISA两种麻疹抗体检测方法结果的相关性,并初步探讨新生儿对麻疹易感的原因.方法:采集本院住院的85例小于9月龄麻疹患儿母亲血清,同时采集13位幼年患过麻疹的育龄妇女血清作为对照.通过细胞培养测定血清中和抗体滴度,同时使用ELISA诊断试剂定量检测麻疹IgG抗体,统计学分析比较两种检测结果的相关性.结果:98例血清ELISA法和中和试验法两者均阳性89例,总符合率为90.82%,两者结果不符合主要见于抗体浓度较低的标本;两种检测方法麻疹抗体检测结果具有正相关性(R=0.8285,P＜0.001).当中和抗体滴度大于1:16时,ELISA抗体浓度均高于200 mIU/ml;而当ELISA抗体浓度均高于700 mIU/ml,中和抗体均阳性.患儿患病时,其母亲麻疹ELISA抗体平均水平633 mIU/ml,平均中和抗体滴度1:37,而幼年有麻疹史的同龄妇女麻疹ELISA抗体平均水平为1498 mIU/ml,中和抗体滴度为1:182;两组差异有统计学意义(P＜0.05).结论:中和试验和ELISA麻疹抗体检测结果具有良好的相关性;ELISA麻疹抗体浓度高于700mIU/ml是麻疹中和抗体阳性的可靠指标.婴幼儿麻疹易感性增加与其母亲麻疹抗体低下有关.     

乙型肝炎病毒pre-S1区中和抗体可变区的原核表达

鼠源单克隆抗体MA18/7是特异识别乙型肝炎病毒 (HBV)pre S1抗原的中和抗体。为表达MA18/7的小分子抗体 ,将MA18/7的重链可变区基因(V_H)和轻链可变区(V_L)基因分别克隆到原核表达载体pTO-T7进行原核表达。结果V_H和V_L均以包涵体的形式高效表达 ,包涵体经过变性、复性及金属离子亲和纯化后获得纯度>90%的重组抗体片段。生物传感器、竞争ELISA和间接ELISA测定均显示 ,V_H 或V_L 均不能结合相应抗原 ,但二者体外混合后可迅速非共价结合形成具有良好活性的可变区抗体Fv,表明MA18/7的抗原结合活性区由重链可变区和轻链可变区共同组成.     

应用BHK21细胞检测汉坦病毒中和抗体方法的建立

本文报道应用汉坦病毒（HV）Ⅰ型76－118、Chen、J3、J5、J12,和Ⅱ型UR、R22、L99等8株病毒在BHK21细胞上培养和观察,发现病毒感染BHK21细胞后可规律出现病变,且可测出病毒滴度。分别应用BHK21细胞与Vero-E6细胞同时做空斑减少中和试验（PRNT）检测同批血清的抗体中和效价,结果一致,且稳定性特异性好,因此BHK21细胞可作为研究HV的另一个敏感实验细胞系,对研究HV的某些生物学特性及实验方法均有实用价值。     

Antibody Cocktail Exhibits Broad Neutralization Activity Against SARS-CoV-2 and SARS-CoV-2 Variants

Virologica Sinica - Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has precipitated multiple variants resistant to therapeutic antibodies. In this study, 12 high-affinity antibodies...     

Neutralization and durability of 2 or 3 doses of the BNT162b2 vaccine against Omicron SARS-CoV-2

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抗新型冠状病毒单克隆中和抗体药物研发进展*

随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球的不断蔓延,开发有效的治疗药物迫在眉睫。中和抗体作为最有希望的新型冠状病毒特异性治疗药物,已经在临床研究中展现很好的治疗效果。对抗新冠病毒单克隆中和抗体药物研发的进展、涉及的主要技术和主要临床试验结果进行了总结,以期为包括COVID-19在内的新发、突发传染病中和抗体药物研发提供参考。     

Structural basis of nanobodies neutralizing SARS-CoV-2 variants

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Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2

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新冠病毒刺突糖蛋白结构与功能的生物信息学分析及原核表达

SARS-CoV-2是一种高致病性且传播迅速的病原体,通过刺突糖蛋白(Spike glycoprotein,S蛋白)识别宿主细胞表面的受体来实现入侵和感染。对S蛋白进行系统的生物信息学分析和原核表达,有助于深入理解S蛋白的功能和阐明该蛋白介导病毒感染的分子机制。本文采用Protparam、Pfam、TMHMM、ExPASy-ProtScale、PSORTⅡ、SignalP、UniProt、NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 4.0和BLAST等生物信息学软件和数据库对S蛋白的理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰及相互作用网络等生物学特性进行了系统分析。利用Clustal X2和MEGA7.0软件对该蛋白进行了基于氨基酸序列的同源性分析和系统进化分析。最后,通过分子克隆技术构建重组表达载体pET-22b-S并进行原核表达。结果显示,S蛋白由1273个氨基酸组成,分子量141.2 kD,等电点6.24,有两个卷曲螺旋结构,一个跨膜螺旋区,疏水性较强。S蛋白包含刺突受体结合结构域和S2糖蛋白结构域,主要分布于宿主细胞的内质网膜和细胞膜,含有136个潜在的磷酸化位点和20个可能的糖基化位点。与SARS-CoV-2 S蛋白序列一致性最高的是SARS冠状病毒、SARS冠状病毒WH20和蝙蝠冠状病毒HKU3,均为76%。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒聚为一大支,提示它们可能具有共同的祖先。S蛋白主要在细菌裂解液离心之后的沉淀中表达,这为后续的结构分析和疫苗研发奠定了基础。S蛋白在SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒之间保守性较高,提示其在病毒入侵过程中具有重要功能。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒可能具有共同的祖先。本研究为SARS-CoV-2 S蛋白的表达纯化、结构与功能研究提供了重要的数据基础,有助于全面揭示S蛋白的生物学功能,同时为设计和筛选靶向S蛋白的新型抗病毒药物提供了科学依据。     

新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2（简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2）S蛋白受体结合域（receptor binding domain, RBD）并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上,电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白,经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示,成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD,在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1∶3 000,并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性,为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。     

菠菜SoHb基因的原核表达及功能分析

为了进一步揭示菠菜非共生血红蛋白(SoHb)的功能,通过RT-PCR的方法从菠菜根中克隆了SoHb基因编码区全长序列,并将其克隆到原核表达载体pET32a上,构建原核表达载体p ET32a-SoHb,并转化大肠杆菌BL21 star(DE3)获得原核表达工程菌株。通过IPTG法诱导该重组质粒在大肠杆菌中得到高效表达,融合蛋白分子质量约为38 kDa,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经Ni2+NTA亲和柱纯化,获得纯化的融合蛋白。与空载体相比,重组菌对硝化胁迫的抗性增加。以纯化的融合蛋白为抗原免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,并对其进行了Western blot检测。实验结果为进一步研究菠菜SoHb基因功能奠定了基础。