非小细胞肺癌中LASS2/TMSG1的表达及其临床意义

目的探讨LASS2/TMSG1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及与临床病理特征、预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测NSCLC和癌旁正常组织中LASS2/TMSG1蛋白的表达,分析其表达与NSCLC临床病理特征的关系,并进行术后随访。结果LASS2/TMSG1蛋白在NSCLC组织中的表达(21/87,24.13%)明显低于正常肺组织(15/25,60.00%)。LASS2/TMSG1在NSCLC组织中的表达与肿瘤分化、淋巴结转移呈负相关(P<0.05),且LASS2/TMSG1阳性患者的总生存期及无瘤生存期均明显高于LASS2/TMSG1阴性患者(P<0.05)。多因素Cox分析显示,LASS2/TMSG1是NSCLC患者的独立预后因素。结论LASS2/TMSG1可能抑制肺癌的发生、分化及转移,有望成为肺癌患者的预后指标之一。     

LASS2／TMSG-1基因与肿瘤转移关系的研究进展

人源性长寿保障基因2（homo sapiens longevity assurance homologue 2,LASS2）是一个与酵母长寿保障基因l（10ngevity assurance gene1,LAG1）高度同源的人类基因,又被称为肿瘤转移抑制相关基因1（tumor metastasis suppressor gene-1,TMSG-1）。目前研究发现LASS2／TMSG-1与神经酰胺合成密切相关,同时其与V-ATPase质子泵的相互作用被认为是抑制肿瘤转移的机制之一,多种肿瘤的转移都与此基因的表达相关。     

LASS2/TMSG-1基因过表达对人肺癌95D细胞体外侵袭迁移能力的影响及其机制

目的分析LASS2/TMSG-1基因过表达对人肺癌95D细胞体外侵袭迁移能力的影响,初步探讨LASS2/TMSG-1基因的作用机制。方法运用脂质体转染法将前期已构建好并冷冻保存的Pc DNA3-TMSG-1质粒通过脂质体转染法瞬时转染入95D细胞(高转移潜能,LASS2/TMSG-1低表达),使外源性LASS2/TMSG-1基因在细胞内过表达即LASS2/TMSG-1过表达组,同时设立转染空白质粒的空白对照组和未转染质粒的阴性对照组。应用体外侵袭及迁移实验检测人肺癌95D细胞侵袭及迁移能力的变化;应用qRT-PCR和Western blot法检测LASS2/TMSG-1 mRNA及蛋白的表达;应用Western blot法检测ATP6L、MMP-2及MMP-9在细胞中的表达水平;应用明胶酶谱法检测肿瘤细胞中MMP-2及MMP-9的活性;使用比色法检测细胞中V-ATPase的活性;使用BCECF H+敏感探针检测细胞外H+浓度的变化。结果 LASS2/TMSG-1过表达组细胞的LASS2/TMSG-1表达水平明显升高,而ATP6L表达水平下降,其V-ATPase活性及细胞外H+浓度降低,与空白对照组和阴性对照组相比差异均具有统计学意义(P0.05);MMP-2、MMP-9的表达及活性均降低,与其他两组相比差异有统计学意义(P0.05);并且LASS2/TMSG-1过表达组细胞的体外侵袭及迁移能力明显低于其他两组(P0.05)。结论 LASS2/TMSG-1可能通过结合ATP6L亚基抑制V-ATPase活性,改变细胞外H+浓度,影响MMP-2、MMP-9的表达及活性,进而改变肿瘤细胞的体外侵袭迁移能力等生物学行为。     

人CD226 (PTA1)分子胞膜外区截短体真核表达载体的构建、表达及其识别结构域的分析

目的：确定一套CD226单克隆抗体（McAb）识别CD226分子胞膜外区结构域的部位，方法：应用计算机软件分析CD226子蛋白质序列疏水性，确定其亲水性区域。采用PCR方法扩增CD226分子基因序列，分别缺失相应亲水性区域，构建CD226截短体重组真核组细胞表达载体pcDNA3-PTA1T1和pcDNA3-PTA1T2。测序正确后，转染COS7细胞，抗CD226分子克隆抗体间接免疫荧光染色，流式细胞术检测CD226分子截短体的表达，表达成功后，采用间接免疫荧光染色和流式细胞术分析，用一套CD226McAb检测与截短突变体的免疫反应性，从而确定CD226McAb识别CD226分子结构域的部位。结果：PCR扩增出CD226分子相应目的片段序列，定向克隆入pcDNA3真核表达。CD226McAb Leo A1,New E1T -7均可识别CD226全长分子；Leo A1,New E1,FMU1,FMU2,FMU4和MFU5与截短突变体PTA1T1和PTA1T2均无反应性，FMU3可结合PTA1T1分子，不结合PTA1T2分子；FMU6和FMU7均可结合PTA1T2均无反应性；FMU3可结合PTA1T1分子，不结合PTA1T2分子；FMU6和FMU7均可结合PTA1T1及PTA1T2分子，结论：CD226McAb Leo A1,New E1,FMU1,FMU2,FMU3,FMU4和FMU5识别CD226分子膜膜外区D1结构域，其中FMU3识别的位点位于V1和V2环之间；FMU6和FMU7识别D2结构域。     

人肿瘤转移抑制基因1转染对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的影响

目的研究人肿瘤转移抑制基因1（TMSG-1）转染引起人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的改变及对肿瘤转移表型的影响。方法构建TMSG-1全长编码序列真核表达载体,稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,G418筛选挑取TMSG-1过表达阳性克隆。通过MTT比色实验、软琼脂集落形成实验检测体外细胞生长能力;Matrige1穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。TMSG-1瞬时转染24、48h,分别用Annexin-V碘化丙啶（PI）双标流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。结果从稳定转染TMSG-1的MDA-MB-231细胞中挑取3个TMSG-1-FLAG融合蛋白表达量较高的阳性克隆株用于下游生物学行为实验。M1Tr比色实验及软琼脂集落形成实验结果显示,TMSG-1正义转染各组（S1、S2、S3）细胞增殖速度及克隆形成数与未转染组及转染空载体组相比均明显减低（P〈0．05）;Matrigel穿膜实验显示,正义转染各组的穿膜细胞数[（72．3±8．1）个、（85．0±4．2）个、（73．5±7．8）个]与未转染组[（187．5±2．1）个]和转染空载体组[（162。3±6．8）个]相比均明显减少（P〈0．01）。TMSG．1瞬时转染MDA．MB-231细胞,转染24和48h均可引起细胞凋亡率的增加（P〈0．05）。结论TMSG．1表达上调可使人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生长速度、锚着不依赖性生长能力及侵袭能力明显降低,细胞凋亡增加。该实验为TMSG-1是一个新发现的肿瘤转移抑制基因提供了证据。     

USP14全长及截短表达质粒构建及其在子宫内膜癌中功能的初探

目的 构建USP14全长及截短表达质粒并且初步探讨USP14在子宫内膜癌中的作用.方法 设计USP14全长及截短的特异性引物,通过PCR合成相应cDNA片段,并用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切,连接转化后将构建好的质粒进行测序,成功构建后将其转染至COS7中,观察全长及截短在COS7中分布.通过划痕实验...     

ACSL3在前列腺癌细胞系中的表达及其对前列腺癌转移的影响

 目的:观察比较长链脂酰辅酶A合成酶3（long-chain acyl-CoA synthetase 3, ACSL3）在前列腺正常上皮细胞和不同类型前列腺癌细胞系中的表达差异,通过构建ACSL3基因稳定表达的前列腺癌细胞株研究ACSL3对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。方法:利用RT-PCR方法检测ACSL3 mRNA在前列腺正常上皮细胞、局限性及转移性前列腺癌细胞中的表达情况,分析其表达与前列腺癌发生、进展及转移的关系;以前列腺癌细胞基因组cDNA为模板,通过PCR扩增ACSL3基因,重组构建含有Flag标签的pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3质粒,包装慢病毒,转染前列腺癌细胞,通过荧光显微镜、RT-PCR和Western blotting等方法鉴定ACSL3在细胞内的表达情况;利用Transwell侵袭实验研究ACSL3对前列腺癌细胞侵袭能力的改变。结果:较前列腺正常上皮细胞,各种前列腺癌细胞中ACSL3 mRNA表达均明显下降。同时,局限性前列腺癌细胞中ACLS3 mRNA表达较转移性前列腺癌细胞明显升高;此外,雄激素非依赖性前列腺癌细胞比雄激素依赖性前列腺癌细胞中ACLS3 mRNA表达显著降低。进而,我们成功构建和包装了表达ACSL3基因的pCDNA3.1(+)-Flag-ACSL3重组质粒及慢病毒,并转染前列腺癌细胞,筛选出稳定表达株;并且,通过Transwell实验证实ACSL3表达与前列腺癌细胞的侵袭能力呈负相关。结论:前列腺正常上皮细胞及不同前列腺癌细胞系中ACSL3的表达存在明显差异,提示ACSL3可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用;成功构建了ACSL3基因稳定表达的前列腺癌细胞株,并初步证实ACSL3过表达可以抑制前列腺癌细胞的侵袭力。     

鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因影响高转移人前列腺癌细胞体外生物学行为的机制探讨

目的 探讨鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(PAG1)基因对高转移人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞体外生物学行为影响的机制.方法 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导JM109细菌中GST-Raf1-Ras结合域(GST-Raf1-RBD)融合蛋白的表达,其中Raft-RBD能特异性的与活性Ras(GTP-Ras)结合,聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色观察融合蛋白诱导表达结果.GST-pull down实验检测稳定转染PAG1基因、转染空载体及未转染的PC-3M-1E8细胞中活性Ras水平.Western blot检测Ras信号通路相关蛋白表达变化.用异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白,激光扫描共聚焦显微镜观察肿瘤细胞形态和细胞内F-肌动蛋白排列变化.收集人前列腺及前列腺腺癌组织标本,通过免疫组织化学PV9000法检测PAG1蛋白的表达.结果 GST-Raft-RBD融合蛋白诱导表达结果显示,经IPTG诱导后在相对分子质量约33 000处出现较亮的GST-Raf1-RBD融合蛋白条带.GST-pull down结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,活性Ras蛋白表达明显减少,总Ras蛋白表达无明显变化.Western blot检测结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,磷酸化胞外信号调节激酶(ERK)表达明显减少,总ERK表达无明显变化;细胞周期素D1(cyclin D1)表达明显减少;p21WAF1/CIP1蛋白及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达无明显变化.TRITC耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白结果显示稳定转染PAG1基因的PC-3M-1E8细胞F-肌动蛋白骨架结构紊乱,丝网状结构不明显,细胞呈长梭形,细胞表面伪足明显较少.免疫组织化学检测结果显示正常前列腺组织PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中随着Gleason分级的增加,PAG1蛋白表达阳性率降低.结论 PC-3M-1E8细胞中PAG1表达上调能降低Ras活性,抑制ERK活化,进一步抑制cyclin D1的表达而引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖.PAG1表达上调可引起PC-3M-1E8细胞运动、侵袭和转移能力降低.正常前列腺组织中PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中PAG1蛋白的表达与肿瘤细胞的分化程度及恶性程度相关.     

肿瘤中1号染色体短臂的分子细胞遗传学

肿瘤的发生有其分子细胞遗传学基础 ,染色体结构异常的区域往往是肿瘤相关基因所在位点。 1号染色体的短臂末端 (1p36 )集中了高密度的与细胞生长、增殖、分化相关的基因 ,同时目前发现在许多肿瘤中其 1p36发生缺失 ,因而成为目前肿瘤分子细胞遗传学研究的热点。本文就有关 1p36上的肿瘤相关基因和研究方法以及近几年在神经母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌等肿瘤中的研究进展作简要阐述     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

Arp2/3复合体在细胞运动以及肿瘤转移中机制的研究进展

Arp2/3复合体是一个主要的肌动蛋白组装成核剂,能够促进微丝的核化,从而促进细胞内肌动蛋白单体装配形成微丝,这在细胞运动等多种与肌动蛋白细胞骨架相关生理活动中具有重要作用,最近研究发现,Arp亚基基因在肿瘤内异常表达,研究其与肿瘤之间的关系在肿瘤早期诊断和基因治疗方面有重要的理论指导意义。本文综述了近年来有关Arp2/3复合体的分子结构,功能特点以及在肿瘤中作用等相关的研究,为Arp2/3复合体的进一步研究提供一定的参考。     

PSMA基因沉默的前列腺癌细胞中肿瘤转移相关基因表达的芯片分析

目的: 探讨前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)在前列腺癌转移过程中的作用通路。方法: 针对PSMA mRNA序列设计合成siRNA序列,脂质体转染LNCaP细胞特异性下调PSMA基因的表达,通过肿瘤转移基因芯片分析84个肿瘤转移相关基因的表达差异。结果: 成功设计了siRNA序列并制备最佳干扰效果的干扰样,mRNA干扰效果达到75%以上,蛋白水平干扰效果达68%以上。通过基因芯片检测发现在下调PSMA基因表达后,有CDH6、CXCL12等10个基因发生了显著上调,而CCL7、MDM2等4个基因发生显著下调表达。结论: 初步发现PSMA参与前列腺癌转移信号通路的调节,为进一步研究PSMA的生物学功能,探索前列腺癌的转移机制奠定了基础。     

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。     

肾素前体激活人肾系膜细胞ERK1/2诱导TGF-β的表达

目的:观察肾素前体(prorenin)能否激活体外培养的人肾系膜细胞(HRMCs)膜表面的肾素(前体)受体[(P)RR],从而活化细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路。方法:体外培养HRMCs。以血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)阻断剂olmsartan和血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)阻断剂PD123319孵育细胞,再以prorenin刺激细胞,并用ERK1/2抑制剂PD98059和HRP(handle region peptide)干预。用免疫蛋白印迹方法(Western blotting)和酶标记免疫吸附测定方法(ELISA)测定目的蛋白水平,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定mRNA水平。结果:Prorenin作用于体外培养的HRMCs后,在阻断AT1和AT2受体时,能激活(P)RR使ERK1/2磷酸化增强、转化生长因子(TGF-β)水平增高。这种ERK1/2信号通路的激活是(P)RR激活后效应,并可被ERK1/2信号通道阻断剂PD98059阻断。HRP不能阻断(P)RR激活所致的ERK1/2磷酸化,不能使TGF-β表达降低。结论:在体外培养的HRMCs中,prorenin能够激活(P)RR,使ERK1/2信号通道活化导致TGF-β水平增高。而HRP不能阻断(P)RR激活后ERK1/2的磷酸化及TGF-β表达的增多。     

鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因的筛选及其对转移性前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的 筛选肿瘤转移相关新基因,探讨鞘精脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因(PAG1)转染对人前列腺癌细胞系PC-3M的高转移亚系PC-3M-1E8体外生物学行为的影响.方法 利用PC-3M高转移亚系PC-3M-1E8、低转移亚系PC-3M-284,人肺巨细胞痛细胞系(PG)高转移亚系PG-BE1和低转移亚系PG-LH7 cDNA制作4张基因芯片,筛选出PC-3M和PG高、低转移亚系共同差异表达基因.对在两个转移亚系共同表达下调的PAG1基因做进一步研究,采用即时定量PCR及Western blot验证PAG1在PC-3M细胞系中的表达.构建pcDNA3.0-PAG1真核表达载体,稳定转染PC-3M-1E8细胞.MTT比色实验及软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞体外增殖能力;流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡;Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力.结果 基因芯片初步筛选出PC-3M高、低转移亚系差异表达基因共327个,上调基因123个,下调基因204个.PG高、低转移亚系差异表达基因共281个,上调基因167个,下调基因114个.PC-3M与PG高转移亚系共同表达下调基因9个、上调基因8个.即时定量PCR及Western blot证实PAG1在PC-3M高转移亚系中表达低于低转移亚系.MTT比色及软琼脂集落形成实验显示转染pcDNA3.0-PAG1组细胞增殖速度明显低于转染空载体组和未转染组(均P<0.05).细胞周期检测转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组处于G_0～G_1期的细胞百分数明显增加(P<0.05).转染pcDNA3.0-PAG1组与转染空载体组和未转染组相比凋亡细胞百分率无显著差异(P>0.05).体外穿膜侵袭实验结果表明转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少,分别为(35.1±4.9)、(127.6±6.6)和(135.0±5.0)个(P<0.05).结论 利用同一母系来源的高、低转移亚系制作基因芯片可以摒除转移无关基因的干扰,筛选出差异表达的肿瘤转移相关基因.PAG1基因稳定转染能抑制人前列腺癌高转移亚系PC-3M-1E8细胞的体外增殖能力和侵袭能力,PAG1基因可能是一个潜在的肿瘤增殖、侵袭和转移的抑制基因.     

肿瘤免疫抑制因子对人T细胞功能的影响及其机理探讨

本文观察了数种瘤株培养上清对人T细胞的增值、IL—2的产生及其反应性的影响,并就其机理进行了初步探讨。结果表明:各种来源的TDSF对上述反应均有强烈的抑制作用。共培试验结果提示,抑制性细胞亚群的活化可能是TDSF发挥抑制作用的重要机理之一。TDSF作用十分强烈,这是应用IL—2等对肿瘤进行过继性免疫治疗时应该注意的问题。     

消化道肿瘤患者Th1/Th2细胞的监测和分析

为观察肿瘤患者外周血Th1/Th2细胞数及其与肿瘤的相关性。Th1/Th2细胞的检测采用酶联免疫斑点法 (ELISPOT ) ,细胞因子的检测采用双抗体夹心ELISA法。结果胃癌患者Th1/Th2细胞比值降低 (P <0 0 5 )。经IL 12 +抗IL 4单抗处理组 ,Th1/Th2细胞比值升高 ;经IL 4 +抗IFN γ单抗处理组 ,Th1/Th2细胞比值降低 (P <0 0 5 )。胃癌、结直肠癌患者外周血中Th2细胞均占优势 ,其Th1型细胞因子IL 2和IFN γ与正常人相比显著降低 ;Th2型细胞因子IL 4、IL 6和IL 10与正常人相比显著升高 (P <0 0 5 ) ;同时 ,TNF α显著升高 (P <0 0 5 ) ;IL 12降低 ,其中结直肠癌患者与正常人比没有显著差异 (P >0 0 5 ) ,胃癌患者与正常人比有显著差异 (P <0 0 5 )。此外还发现随着肿瘤分化程度的降低 ,Th1型细胞因子的降低和Th2型细胞因子的升高更加明显 (P <0 0 5 )。肿瘤患者Th1/Th2细胞比值降低 ,同时 ,Th1型细胞因子降低 ,Th2型细胞因子升高。但在肿瘤的免疫治疗过程中 ,通过诱导IL 12等Th1型细胞因子的分泌 ,可促进细胞免疫应答 ,有助于疾病的治疗。     

肿瘤坏死因子α调控ERK1/2信号通路促进长骨骨样细胞凋亡

文题释义：肿瘤坏死因子α：是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子,并参与正常炎症反应和免疫反应。MAPK信号通路：生物体内重要的信号转导系统之一,参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种生理及病理过程,ERK是MAPK通路中极其重要的组成部分之一。激活的ERK1/2通过核转位进入细胞核,激活其下游的相关转录因子或激活胞质和胞核激酶等调控细胞的生存、增殖和分化。背景：肿瘤坏死因子α作为促炎因子可诱导成骨细胞凋亡,增强破骨细胞功能,从而造成炎症性骨破坏,但是其作用机制尚不明确。 目的：探讨炎症因子肿瘤坏死因子α对长骨骨样细胞MLO-Y4增殖、凋亡的影响及可能机制。方法：将MLO-Y4细胞分为对照组、肿瘤坏死因子α组、ERK1/2抑制剂组。肿瘤坏死因子α组用含50 μg/L肿瘤坏死因子α的α-MEM完全培养基孵育24 h,ERK1/2抑制剂组用含50 μmol/L PD98059的α-MEM完全培养基孵育24 h,对照组单纯采用α-MEM完全培养基孵育24 h,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒检测细胞氧化应激水平,用Western blot法测定PCNA、cleaved caspase-3、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白水平。结果与结论：①与对照组相比,50 μg/L肿瘤坏死因子α处理24 h后,细胞增殖能力下降,凋亡率上升;细胞脂质过氧化物丙二醛水平显著增加,而抗氧化物酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低;②与对照组相比,肿瘤坏死因子α组细胞增殖相关蛋白PCNA的表达显著降低,细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达显著升高,p-ERK1/2的表达降低,而总蛋白ERK1/2的表达基本保持不变。ERK1/2抑制剂组上述指标与肿瘤坏死因子α组无显著差异;③结果表明,50 μg/L肿瘤坏死因子α可使长骨骨样细胞MLO-Y4增殖能力下降,细胞凋亡增多,其作用机制可能与抑制MAPK-ERK1/2信号通路的活化有关。ORCID: 0000-0003-0863-8618(史方富)中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

抑制miR-218的表达对人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及其机制

目的 探讨抑制miR-218的表达对人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其机制。方法 培养人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞,分为空白组、阴性对照组(NC组)、miR-218组;空白组未予以任何处理,NC组转染阴性对照序列,miR-218组转染miR-218抑制剂。各组细胞处理后继续培养5 d,然后收集细胞,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测转染后各组细胞miR-218的表达情况,采用WST-1细胞增殖实验和细胞平板克隆形成实验检测转染后各组C4-2细胞增殖、活性情况,采用划痕实验检测各组C4-2细胞迁移距离,采用Transwell小室检测细胞侵袭数量和迁移数量,采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测TOB1基因mRNA表达情况,采用Western blot检测TOB1基因蛋白表达情况。结果 qPCR结果显示:转染后NC组、miR-218组人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞miR-218的相对表达量分别为1.02±0.06、0.38±0.04,miR-218组中miR-218的表达明显低于NC组,差异有统计学意义(t=15.372, P＜0.05)。WST-1细胞增殖实验结果显示:(1)转染后空白组、NC组随着时间的延长,光密度(OD)值呈上升趋势,而miR-218组OD值在24、48 h时呈上升趋势,72 h时OD 值开始明显下降;(2)空白组、NC组、miR-218组组间比较,OD 值在0、24 h时3组间差异均无统计学意义(P值均＞0.05),48、72 h时miR-218组OD 值均小于空白组、NC组,差异均有统计学意义(F=12.615、24.523,P值均＜0.05)。细胞平板克隆形成实验结果显示:转染后空白组、NC组和miR-218组克隆形成数分别为(42.2±1.2)个、(41.3±2.4)个、(20.6±1.2)个,miR-218组明显少于空白组、NC组,差异均有统计学意义(F=155.530,P＜0.05)。划痕实验和Transwell小室细胞侵袭、迁移实验结果显示:转染后,miR-218组细胞迁移距离、侵袭细胞数和迁移细胞数均低于空白组和NC组,差异均有统计学意义(F=17.625、48.625、38.352,P值均＜0.05);而空白组和NC组间细胞迁移距离、侵袭细胞数和迁移细胞数比较,差异均无明显统计学意义(P值均＞0.05)。RT-PCR和Western blot检测结果显示:转染后空白组、NC组、miR-218组TOB1基因mRNA的相对表达量分别为 0.20±0.02、0.19±0.03、0.35±0.02,TOB1基因蛋白的相对表达量分别为0.22±0.01、0.23±0.02、0.68±0.02,miR-218组细胞中TOB1 mRNA和蛋白水平均明显高于空白组和NC组,差异均有统计学意义(F=18.615、22.523,P值<0.05);而空白组细胞中TOB1 mRNA和蛋白水平与NC组比较,差异均无统计学意义(P值>0.05)。结论 抑制人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞miR-218的表达,可抑制该细胞的增殖和活性,并抑制其侵袭和迁移能力,其机制可能与上调TOB1基因mRNA和蛋白表达有关。     

慢性乙肝患者树突状细胞对Th1/Th2分化的影响

探讨慢性乙肝患者树突状细胞(dendritic cells,DC)对CD4+Th细胞亚群分化的影响。分离慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC),以rhIL-4(50 ng/ml)、rhGM-CSF(10 ng/ml)和rhTNF-α(100 u/ml)诱导培养DC。以流式细胞仪检测DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子表达情况。MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞亚群,PMA+Ionomycin刺激后胞内荧光染色,流式细胞仪检测辅助性T细胞(helper T cell,Th)内特征性细胞因子IFN-γ/IL-4以判断Th1/Th2分化。ELISA法检测DC或Th细胞培养上清中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-4的含量。结果:慢性乙肝患者的DC表达CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子水平明显低于正常人(P<0.01);培养至第7天,慢性乙肝患者DC分泌的IL-12水平低于正常人(P<0.01),而分泌的IL-6水平增高(P<0.05)。与正常人相比,慢性乙肝患者外周血中Th1细胞占CD4+T细胞的百分比较低(P<0.01),其Th细胞培养上清中IFN-γ的量也较低(P<0.01)。患者DC与同种异体的健康人Th细胞共培养,刺激Th1型细胞因子IFN-γ产生的能力低于正常人(P<0.01)。慢性乙肝患者体内DC功能的异常可能导致了外周血Th1细胞分化不足。