禽流感病毒核蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　以 1株H5N1 亚型禽流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　提取禽流感病毒RNA ,以RT PCR法扩增编码NP基因cDNA并测序 ,将其克隆到pET 2 8a原核表达载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE和Westernblot检测表达产物。结果　所克隆的核苷酸片段包含了核蛋白基因完整阅读框架 ,编码 4 98个氨基酸 ,构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量约为 5 5 0 0 0的重组蛋白 ,该重组蛋白具有良好的免疫原性。结论　已成功克隆和表达了禽流感病毒核蛋白基因 ,为禽流感新型免疫学诊断试剂的研制奠定了基础     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3基因的克隆及原核表达

目的克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础。方法提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为27000和20000,主要以包涵体的形式表达。重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别。结论已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达。     

宫颈癌CTL表位疫苗TATHPV蛋白的构建与表达

目的　构建宫颈癌的CTL表位疫苗 ,并在大肠杆菌中表达。方法　应用PCR的方法合成编码CTL表位疫苗基因序列 ,将其亚克隆入pET2 8a- TAT表达载体中 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达重组蛋白 ,用Westernblot对重组蛋白进行鉴定。结果　通过 4轮PCR获得疫苗的基因片段 ,构建的重组表达载体pET2 8a -TAT -HPV在大肠杆菌中得到高效表达 ,Westernblot检测显示特异性条带。结论　构建的宫颈癌CTL表位疫苗在大肠杆菌中得到了表达 ,为该疫苗的功能性研究奠定了基础。     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段的基因克隆和原核表达

目的克隆人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段并构建其原核表达系统。方法用PCR法从人巨细胞病毒AD169株基因组DNA中扩增gB/AD-1片段并克隆至pGEM-T载体,酶切后,亚克隆至表达载体pET-15b,构建重组表达质粒pET-15b/gB/AD-1,并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析一步纯化,并用Westernblot鉴定。结果gB/AD-1蛋白表达量达到35%。表达产物经纯化后,纯度大于95%。经Westernblot检测,表达产物与CMV阳性人血清发生特异性反应。结论已成功构建重组表达载体pET-15b/gB/AD-1,并在大肠杆菌中高水平表达gB/AD-1。     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　以鸡脾细胞mRNA为模板扩增编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　用PHA和LPS激活的AA肉鸡脾细胞 ,提取mRNA ,以RT PCR法扩增出编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA并测序 ,与pET 2 8b载体构建重组质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE检测表达产物。结果　所克隆的核苷酸片段包含了鸡IL 18全部成熟蛋白编码基因 ,其大小为 5 0 7个核苷酸 ,编码 16 9个氨基酸 ;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量为 190 0 0的重组蛋白。结论　已成功克隆和表达了鸡IL 18成熟蛋白基因。     

丙型肝炎病毒非结构区NS5基因片段的克隆和表达

从抗 HCV和HCVRNA均为阳性的病人血清中 ,采用RT PCR技术扩增得到HCVNS5基因片段。用含此基因片段的重组质粒pET 2 8a转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后可高效表达NS5蛋白。该蛋白可用固定化金属离子螯合层析法 (IMAC)纯化。经Westernblot和ELISA检测结果表明 ,纯化的NS5蛋白可与丙型肝炎患者血清发生特异反应 ,在HCV感染的诊断中可能具有良好的应用前景。     

HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究

目的　构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒 ,研究高效表达聚合酶蛋白的最适条件、表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件 ,同时分析其二级结构 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件。方法　采用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增 ,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列 ,构建原核表达载体。在多个载体中选取pET 30a作为表达载体 ,选择诱导表达条件。利用Ni2 + 金属离子螯和亲和层析将其纯化。同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究 ,对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析。结果　测序及读码框架分析结果表明 ,按照上述技术路线得到了相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下 ,诱导表达融合蛋白 (相对分子质量 6 5 0 0 0 ) ,其最高表达量为18 9% ,纯度大于 92 83% ,Westernblot法检测 ,能与HCVNS5b单抗反应 ,证明其为NS5b蛋白。对其二级结构的分析表明 ,已获得了活性基团完整的HCV聚合酶。结论　HCV聚合酶的高效表达和纯化 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础。     

幽门螺杆菌鞭毛蛋白B亚单位原核表达系统的构建及其产物的免疫性

目的　构建幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)鞭毛蛋白B亚单位 (flaB)原核表达系统 ,并鉴定其表达产物的免疫性。方法　采用PCR从幽门螺杆菌基因组DNA中扩增全长flaB基因 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET32a flaB表达载体 ,以E .coliBL2 1DE3为表达宿主菌 ,用SDS PAGE检测重组蛋白 (rFlaB)的表达水平。采用Hp全菌抗体的Westernblot和兔抗rFlaB血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和抗原性。结果　所克隆的flaB基因与文献报道的核苷酸序列同源性为 96 .31%～ 97.73% ,氨基酸序列同源性高达 99.4 1%～ 10 0 %。构建的原核表达系统pET32a flaB E .coliBL2 1DE3的rFlaB产量为细菌总蛋白的 4 0 %左右。Hp全菌抗体能识别rFlaB。rFlaB免疫家兔能获得高效价血清抗体。结论　已成功地构建了HpflaB高效原核表达系统 ,所表达的rFlaB有良好的免疫反应性和抗原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵

目的原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵。方法全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因,克隆入pET22b(+)-X表达载体中,构建重组质粒pET22b-CecropinB-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,最后在5L发酵罐中进行发酵。结果酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Westernblot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c3T3细胞生长的活性,在5L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60g。结论已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因克隆及表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)过氧化氢酶(katA)基因并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌katA全长基因,将其克隆入pET-11c载体中,经测序证实后,在大肠杆菌中进行表达,产物用Western blot检测其抗原性并进行N末端氨基酸的测序。结果 幽门螺杆菌katA基因全长1 518bp,编码氨基酸505个。在BL21(DE3)中的表达量约占细菌总蛋白的24.9％,表达产物经SDS-PAGE显示其相对分子质量与软件预测结果 58 000相符,N末端5个氨基酸测序结果与Hp中天然的katA完全一致,经Western blot检测可被 Hp全菌抗血清识别。结论 katA能在大肠杆菌中进行高效表达,具有良好的免疫反应性,可望为研究 Hp的致病机理、实验诊断及亚单位疫苗等提供充足的katA原材料。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。     

百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性片段的筛选、克隆与表达

目的筛选百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性的片段,并对其进行克隆及表达。方法采用生物信息学软件对丝状血凝素分子的结构进行预测,从中筛选出具有强免疫原性的片段FHAs。经PCR扩增,T-A克隆后,构建表达质粒pET-22b(+)-FHAs,酶切鉴定正确后测序。将测序正确的质粒转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。结果从丝状血凝素分子中筛选出具有138个氨基酸的肽段FHAs,经PCR扩增,得到约400bp的目的基因片段,构建的重组质粒经双酶切和测序鉴定,证明质粒构建正确,重组工程菌pET-22b(+)-FHAs/BL21经IPTG诱导,目的蛋白的表达量在50%以上,主要以包涵体形式存在。Western blot分析证实该蛋白能与抗FHA单抗发生反应。结论筛选出的肽段FHAs具有强的免疫原性和免疫反应特异性,为百日咳基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。     

金黄葡萄球菌肠毒素C3基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达金黄葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)基因。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增SEC3基因中编码成熟蛋白的基因片段,克隆至pET-32a(+)表达载体,构建重组表达质粒SEC3-pET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经PCR扩增获得720bp的SEC3基因;重组表达质粒构建正确;表达产物的相对分子质量约为43000,为可溶性表达;纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆并原核表达了SEC3基因,为单克隆抗体和诊断试剂的制备及SEC3抗毒素的研制提供了材料。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

嗜人类T淋巴细胞病毒Ⅰ型核心蛋白P24基因的克隆与表达

目的 从感染HTLV-1的中国患者外周血单核细胞（PBMCs）中扩增编码HTLV-1核心蛋白P24的cDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法 提取感染者PBMCs基因组DNA,应用巢式PCR方法扩增出HTLV-1核心蛋白P24的cDNA并测序,与pGEX-20T载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达,采用ELISA和Westernblot分析重组蛋白活性。结果HTLV-1核心蛋白P24基因序列高度保守,构建重组载体后,在大肠杆菌中表达的重组蛋白,经检测具有较强的抗原活性。结论 成功地表达了HTLV-1型病毒的核心蛋白P24基因,为国产诊断试剂和疫苗的研发打下了基础。