国内外口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测方法的比较

对国内外3种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测方法和1种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA检测方法,在检测牛血清时的敏感性和特异性进行比较,以期获得可应用于口蹄疫检疫的有效试剂盒。采用国内外3种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA试剂盒和1种阻断ELISA试剂盒,对150份牛血清样品进行ELISA检测。同时对150份样品进行非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验(EITB),以评估4种ELISA检测结果。结果 4种试剂盒的敏感性均达到100%,特异性分别为100%、95%、73%、99%。结论:国内生产的口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒可以用于牛口蹄疫血清学筛选性试验。     

口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒适用范围探讨

为了调查口蹄疫3ABC非机构蛋白抗体在临床诊断健康的动物体内是否存在,以及探索3ABC抗体检测试剂盒的适用范围,设计此试验。随机选取新乡市辖区范围内的猪场4个、牛场12个、羊场9个,采集动物全血,分离血清,利用间接ELISA方法(3ABC-I-ELISA)和荧光PCR方法分别检测免疫过口蹄疫疫苗的健康猪、牛、羊体内非结构蛋白3ABC抗体存在情况和血清中口蹄疫病毒存在情况。结果发现,临床健康动物也会产生口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体,且动物日龄越大,产生抗体的比例越高。表明口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体不仅在野毒感染动物(包括隐性感染动物)体内产生,而且在健康动物中由于免疫频率的增加和免疫剂量的加大也会产生。因此,口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒只适用于对口蹄疫疫情的初筛,且在日龄较小或免疫口蹄疫疫苗次数较少的动物更加适用。     

口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体检测结果分析

随机选取猪、牛、羊场不同日龄动物血清,利用间接ELISA方法（3ABC-Ⅰ-ELISA）检测接种口蹄疫病毒疫苗的健康猪、牛、羊体内非结构蛋白3ABC抗体存在情况.结果发现临床健康动物也会产生3ABC非结构蛋白抗体,且动物日龄越大,产生抗体的比例越高.这可能与日龄越大的动物在生长过程中感染口蹄疫的概率越大有关,或与多次疫苗免疫后导致产生非结构蛋白抗体有关.因此,口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体检测适用于对口蹄疫疫情的初筛,且对日龄较小或免疫口蹄疫疫苗次数较少的动物比较适用.     

区分动物疫苗免疫与病毒感染的口蹄疫非结构蛋白3AB鉴别诊断试剂盒的研制

以口蹄疫非结构蛋白3AB作为抗原的ELISA，适用于鉴别诊断感染和注苗动物。以3ABC基因片段为模板，经RT-PCR扩增得到3AB基因片段，与pET32a连接后，转化宿主菌BL21（DE3）plysS，IPTG诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE和Westemblot结果表明，表达的重组3AB蛋白，分子量约为50Ku，ELISA结果显示，重组3AB蛋白可用于猪、牛口蹄疫病毒感染与疫苗免疫抗体的鉴别诊断。     

Asia1型FMDV非结构蛋白3A基因的克隆、表达与抗原性鉴定

为了研究Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A的抗原性,试验对Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3A基因进行扩增、亚克隆及测序,将3A克隆至表达载体pET-32a(+)中,选取阳性克隆转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导表达和纯化3A蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-blot分析。结果表明:在大肠杆菌中成功地表达了3A蛋白,表达的目的蛋白能与Asia1型FMDV阳性血清发生特异性反应。说明非结构蛋白3A具有较好的抗原活性。     

免疫猪群口蹄疫非结构蛋白抗体与免疫剂量的关系

为了鉴别免疫猪群3ABC抗体阳性猪是免疫动物受到病毒感染引起的,还是疫苗中残留的非结构蛋白引起的,通过检测免疫动物体内的3ABC抗体和病毒感染情况,探讨3ABC抗体的出现与免疫剂量的关系。选取60日龄保育猪20头,分成A、B、C、D 4个组,分别注射猪口蹄疫O型灭活疫苗(OS/99株)1、2、4、6m L/头。每组猪分别在免疫前1 d以及免疫后3、7、14、30和60 d,采集血清和鼻咽拭子,使用口蹄疫3ABC间接ELISA检测试剂盒、口蹄疫多重RT-PCR检测试剂盒以及病毒分离试验,检测3ABC抗体和病毒感染情况,发现保育猪在低剂量(1 m L/头或2 m L/头)免疫后没有检测到非结构蛋白抗体,而高剂量(4 m L/头或6m L/头)免疫后出现非结构蛋白抗体阳性率升高,而且出现非结构蛋白抗体阳性的动物中没有检出病毒感染或病毒核酸。检测结果提示这些免疫猪群非结构蛋白抗体的形成与免疫剂量有关。     

口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China／99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59．1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31．4％。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。     

不同ELISA试剂盒检测感染猪口蹄疫病毒3ABC抗体效果比较

为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。     

3A蛋白间接ELISA试验检测猪口蹄疫感染抗体的研究

用表达的口蹄疫3A蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA试验，对口蹄疫病毒感染血清、免疫血清和其它非口蹄疫病毒血清进行了检测研究。结果表明，3A蛋白间接ELISA试验对口蹄疫具有较好的特异性，可以区分感染口蹄疫病毒的猪血清和疫苗免疫猪血清。     

用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别感染动物与疫苗免疫接种动物

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的发生于偶蹄类动物的一种急性、热性传染病,曾多次在世界上发生过大流行。疫苗接种是防控口蹄疫暴发的有效措施之一,而要控制口蹄疫的流行,首先要将病毒感染动物从疫苗接种群体中区分开来。以口蹄疫病毒非结构蛋白(NSPs)为抗原,分别利用口蹄疫病毒非结构蛋白2C、3B、3AB和3ABC作为鉴别诊断抗原,检测动物体内的NSPs抗体,可有效的区分感染动物与疫苗免疫接种动物。目前,许多实验室已展开此项工作的研究,这为防控口蹄疫打下了良好的基础。     

两种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测方法的比较

对常用的兰州兽医研究所和北京世纪元亨生产的两种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的ELISA检测方法,在检测猪血清抗体时的敏感性进行比较,以期获得可应用于口蹄疫检疫的最佳试剂盒。采用上述两种阻断ELISA试剂盒对170份猪血清样品进行ELISA检测。结果表明,两种试剂盒的阳性检出率相差不大,阳性检出率分别为5. 29%和5. 88%。本试验表明:兰州兽医研究所和北京世纪元亨生产的口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒检测结果差异不大,均可应用于口蹄疫血清学筛选性试验。     

利用重组杆状病毒表达口蹄疫病毒基因研究进展

杆状病毒表达系统是一种新型、高表达的真核表达系统,广泛应用在新疫苗、诊断试剂和新型蛋白药物开发研究方面。不少研究人员报道了利用重组杆状病毒表达口蹄疫病毒基因生产结构蛋白和非结构蛋白,期望表达的蛋白质具有与真实病毒蛋白相似的生物学活性,能够应用于候选疫苗或诊断检测抗原。作者对近几年利用重组杆状病毒表达口蹄疫结构蛋白基因和非结构蛋白基因的研究进展进行了综述,并提出相关问题和困难供商讨。     

天山牦牛口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC检测

为了掌握生活在天山深处牦牛口蹄疫病毒（FMDV）感染情况,采集牦牛血样149份,分离血清后进行口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC检测.结果表明：犊牦牛、青年牦牛以及成年牦牛平均阳性率达7.4％.     

河北省部分地区规模化养殖场羊口蹄疫3ABC抗体检测

为初步了解河北省规模化养殖场羊口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体水平,2018年5月在11个场点采集羊血清354份,用口蹄疫3ABC单抗阻断ELISA试剂盒进行抗体检测。结果显示:从不同市区分析,秦皇岛市抗体阳性率最高,为15.65%,其次是保定市、邢台市,分别为11.11%、2.86%;从不同饲养阶段分析,种羊的抗体阳性率明显偏高,为16.82%,羔羊、育成羊分别为6.53%、10.75%;从不同性别分析,母羊阳性率偏高,为11.7%,公羊为8.33%;从不同品种分析,绵羊阳性率高于山羊,分别为12.75%、4.67%。虽然我国目前使用的灭活疫苗可能会导致产生一定的非结构蛋白抗体,但上述结果能够说明河北省存在口蹄疫自然感染羊只。这提示河北省的口蹄疫防治和净化任务仍然繁重,要根除和消灭本病,可选用非结构蛋白纯化程度高的疫苗进行免疫,同时加强3ABC抗体监测和引种检疫,隔离并淘汰阳性动物。     

肉牛口蹄疫免疫抗体、3ABC抗体、RT-PCR核酸检测结果分析

[目的]为了掌握肉牛口蹄疫免疫抗体检测结果、口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测结果、口蹄疫O-P液RT-PCR核酸检测结果三者的相关性,[方法]张掖市动物疫病预防控制中心对甘州区28头肉牛开展相关检测。[结果]检测结果表明:O型口蹄疫免疫抗体合格率28份,合格率100%,3ABC抗体阳性27份,阳性率96.4%;对3ABC抗体阳性的27头牛分2次进行实时荧光RT-PCR核酸检测,被检的27头牛均为阴性。     

口蹄疫病毒2c基因的克隆及表达

从O型口蹄疫病毒China98株病毒材料中克隆到了非结构蛋白2C的基因，并成功地将该基因在大杆菌中进行了表达，为建立以基因工程产品为抗原，能区分人工免疫和自然感染动物的检疫方法提供也技术和材料条件。 sri     

牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

为研究快速定量检测牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,试验通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中表达可溶性的3A-3B融合蛋白,并基于纯化的可溶性融合蛋白建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。结果表明:建立的方法能够检测牛血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的牛类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床牛血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率96%,阴性样品符合率93.3%,总的符合率95.7%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。文章首次建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法,同传统的ELISA方法相比,该检测方法特异性相当、敏感性更高,操作更简单、快速,具有较高的应用推广价值。     

羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白3A-3B1-3B2抗体ELISA检测方法的建立

为建立检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的间接ELISA方法,通过优化抗原表达条件,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。该方法对其他相关的羊类病毒病原无交叉反应,其重复性组内与组间变异系数均低于10%,具有良好的重复性。对300份临床血清样品进行检测,与国内市售的口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒进行比较,阳性样品符合率为96.67%,阴性样品符合率为94%,总符合率为95.33%。本研究建立的羊血清中口蹄疫病毒3A-3B1-3B2蛋白抗体间接ELISA检测方法,特异性高、敏感性强,操作简单快速,具有较高的应用推广价值。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达

从感染口蹄疫病毒 (foot- and- m outh disease virus,FMDV)的细胞中提取总 RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)获得了长度约为 14 0 0 bp的核酸片段 ,与预期长度相符。扩增产物经克隆后 ,测序证明其含有完整的 3ABC基因。该序列与国外参考序列 0 1K/ 6 6相比 ,同源性在 99%以上。亚克隆 3ABC基因至表达载体 p Tri Ex- 4 Neo中 ,通过序列分析发现 ,克隆到 p Tri Ex- 4 Neo载体上的片段于 3ABC基因 70 9～ 72 5 bp之间有 17bp的缺失 ,碰巧在 3AB基因后形成一终止密码子 ,但 3AB基因的阅读框架完整。选出含有 3AB基因完整阅读框架的阳性克隆 ,用 IPTG诱导表达 ,收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western blotting分析 ,结果表明 ,3AB基因在大肠杆菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 33.5 ku的融合蛋白 ,并能被口蹄疫病毒阳性血清识别。经薄层扫描分析 ,表达的目的蛋白占总蛋白量的 2 6 %以上。该项研究为应用重组 FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫的鉴别诊断方法提供了依据     

三种感染动物阳性血清与口蹄疫病毒重组非结构蛋白的反应原性

本试验通过生物信息学技术比对分析GenBank中口蹄疫病毒(A型、O型和亚洲1型)非结构蛋白的保守序列,根据大肠杆菌密码子偏好性,优化合成了非结构蛋白基因,经过测序和转化,筛选到能够表达重组非结构蛋白的阳性重组菌株。经过Western-blot试验,证明表达的重组非结构蛋白能分别与口蹄疫病毒感染的牛、羊和猪阳性血清发生特异性反应。该重组蛋白待进一步验证后,可用于口蹄疫病毒感染动物的鉴别检测试剂盒研究。