烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱     

两个烟草Nup96基因的分子克隆及其表达分析

为研究烟草低温早花的分子机理,采用RT-PCR结合RACE法,从烟草品种NC82中克隆到2个Nup96基因c DNA全长序列,分别命名为Nt Nup96a和Nt Nup96b,Gen Bank登陆号分别为KU558693和KU558694。序列分析表明2个基因均编码1037个氨基酸残基的蛋白,氨基酸序列一致性为97%,与拟南芥Nup96蛋白(NP_178183)的序列一致性为60%;2个基因编码蛋白具有典型的植物Nup96结构特性,包含1个Nup96结构域和1个自酶解结构域。荧光定量PCR分析表明:在正常的生长条件下,Nt Nup96a和Nt Nup96b在烟草各组织中均有表达,在叶片中的表达量较弱,且随着植株生长其表达量显著下降;在12℃处理10天后,在烟草叶片中2基因的表达都出现了明显的下调,这一结果提示Nup96可能是烟草开花时间调控的抑制因子,其受低温诱导下调表达可能与NC82低温敏感,易早花特性相关。     

普通烟草碳酸酐酶家族基因的生物信息学分析

为挖掘普通烟草碳酸酐酶基因的信息并探讨其功能,本研究利用生物信息学方法,在烟草基因组数据库中对普通烟草碳酸酐酶家族成员进行了检索,并对其理化性质、遗传进化、基因结构、蛋白保守基序、顺式作用元件和组织表达模式进行了分析。结果显示,在普通烟草中至少含有9个α和6个β亚家族成员。在进化关系上,不同亚家族成员之间,序列同源性较低;与水稻相比,拟南芥和普通烟草两个亚家族间的亲缘关系较近。亚细胞定位分析结果显示,烟草α亚家族成员在细胞壁、细胞膜、线粒体、叶绿体、细胞质等细胞器中均有分布,而β亚家族成员均存在于叶绿体中。基因结构和保守基序分析说明,各亚家族成员的基因结构和蛋白保守基序呈现较高的一致性。启动子顺式作用元件分析显示,烟草碳酸酐酶基因的启动子中,均含有多个参与光反应、激素响应、非生物胁迫和机械损伤等相关的顺式作用元件。基因组织表达模式分析表明,烟草的碳酸酐酶基因不同成员在不同组织表达水平存在差异,并呈现出时空特异性。本研究结果为烟草碳酸酐酶基因的功能研究奠定了基础。     

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

甘蓝型油菜TFⅢA型锌指蛋白基因鉴别和表达模式

植物TFⅢA型锌指蛋白的锌指区含有保守的QALGGH区,属于C2H2型转录因子,参与调控植物生长发育和逆境胁迫应答.参照拟南芥AtZFP基因的C2H2结构域氨基酸序列,采用生物信息学方法鉴定了46个甘蓝型油菜TFⅢA型锌指蛋白基因,分析了基因结构、生化特性、进化关系和基因表达模式.结果表明：42个基因为单锌指蛋白基因,4个为多锌指蛋白基因;40个基因不含内含子,6个基因含内含子;46个基因的氨基酸序列同源性变幅为9.0% ～99.2%,氨基酸序列保守性差异明显,亚类成员间包含相同的保守基序,亚类间的保守基序不同;PlantCARE分析发现其启动子区富含激素、非生物胁迫及特定生理过程响应的顺式作用元件;RNA-seq分析表明,部分基因在甘蓝型油菜品种中双11号的根、初花期雌蕊和角果中特异表达.     

烟草祖先种及重要野生种PDR1基因的生物信息学分析

植物的多向耐药性（Pleiotropic drug resistance, PDR）转运蛋白隶属于ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族的G亚家族。该类蛋白参与植物多种初生、次生代谢物的跨膜运输,在植物的生长发育、响应逆境胁迫、解毒过程中起着重要作用。近年的研究还表明,该蛋白与多种植物对真菌病原的抗性有关。本文以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥PDR12蛋白、烟草的PDR1基因为探针,通过搜索同源序列,从数据库中提取烟草及祖先种、重要野生种中的PDR基因、蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构、功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以本氏烟（Nicotiana benthamiana）NbPDR1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以普通烟草（Nicotiana tabacum）NtPDR1基因为例,预测了其基因编辑位点。结果表明,这些PDR基因相似性高,均编码跨膜蛋白,具有典型的跨膜结构域和核酸结合结构域。该基因启动子区有多个与病原真菌诱导、干旱等逆境胁迫响应相关的元件,暗示该基因可能是抗真菌病害、响应逆境胁迫的广谱抗性基因。最后,本文预测的基因编辑位点,为烟草PDR基因的功能研究、基因编辑及抗病育种提供理论基础。      

普通烟草ERF转录因子亚家族成员鉴定及表达模式分析

乙烯结合响应因子(Ethylene-responsive element binding factors,ERF)家族广泛参与植物的生长发育、逆境调节及激素信号应答等过程。利用生物信息方法,鉴定普通烟草基因组ERF转录因子亚家族成员,并对该亚家族成员的染色体定位、理化性质、系统发生、保守结构域、亚细胞定位和组织表达模式进行分析。结果显示,目前在普通烟草中得到121个ERF基因,在烟草24条染色体分布位置具有不均匀性。通过构建进化树,根据拟南芥ERF亚家族的分类方式将烟草ERF亚家族分为6组,同一分组成员的理化性质及保守域呈现高度一致性。亚细胞定位分析结果显示,绝大部分成员定位在细胞核,少数定位在线粒体和叶绿体上。组织表达模式分析结果显示,烟草ERF基因在幼根、成熟根、离体叶和茎中表达量较高,不同分组成员之间表达存在差异。     

普通烟草DREB转录因子的序列鉴定与表达分析

DREB转录因子含有一个保守的AP2/ERF结构域,在植物抗逆过程中起关键作用。利用生物信息学分析手段,以拟南芥DREB家族成员序列为参照,在普通烟草(Nicotiana tabacum)基因组公共数据库中鉴定出了68个DREB转录因子。对烟草DREB转录因子家族进行了理化性质、系统进化、保守结构域和表达分析。结果表明,普通烟草基因组编码68个DREB转录因子家族成员,氨基酸数目差异较大;系统发育分析表明,拟南芥和烟草的DREB转录因子共125个成员形成6个进化分支,其中烟草比拟南芥缺少A6分支;结构域分析表明,同一分支内的DREB转录因子的保守结构域以及motif具有高度的一致性;组织表达分析表明,大多数DREB家族基因在烟草中表达量较低,在衰老、干旱和病害胁迫下基因表达量较多。此研究将为烟草DREB转录因子的深入分析奠定了生物信息学基础。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析

脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶,在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定,并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因,其中12个LOX基因被锚定在染色体上。系统进化分析表明,普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类。共线性分析表明,烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对,并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式。表达模式分析发现,普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性,并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导。因此,普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。     

绒毛状烟草钙依赖蛋白激酶基因家族分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)是一个多基因家族,在植物的钙信号转导中具有重要作用。以拟南芥、普通烟草和烟草属其他种中已知的CDPK序列检索绒毛状烟草基因组框架图数据库,获得绒毛状烟草CDPK基因,并对其进行基因结构、GC含量、系统进化关系、主坐标和基因表达谱分析。结果表明：共分离获得25个绒毛状烟草CDPK基因,它们均具有完整的开放读码框;系统进化树和主坐标分析证实这25个CDPK分布于4个亚家族中;RT-PCR分析显示,绒毛状烟草CDPK基因家族的空间表达存在明显的差异性。此为进一步阐明CDPK基因家族在烟草的钙信号转导过程中的功能及分子机制奠定了重要基础。     

普通烟草Aux/IAA转录因子家族全基因组鉴定分析

Aux/IAA是一种生长素早期响应因子,影响生长素对植物生长发育的调控。烟草作为一种模式植物,在烟草中鉴定Aux/IAA家族基因对于研究生长素调控机制具有重要意义。本研究利用生物信息学方法,从普通烟草基因组中鉴定出77个Aux/IAA家族基因,平均氨基酸数为379,全部为亲水性蛋白,大部分为酸性蛋白。其中46个基因定位到19条连锁群上,分布最多的22号连锁群上有6个基因,其余31个基因位于Scafford上,所有基因均定位于细胞核内。Aux/IAA家族划分为2个类群,10个亚群,包括6对直系同源和40对旁系同源姐妹对,每个亚群中都分布有烟草的Aux/IAA基因。所有的烟草Aux/IAA基因均缺失了结构域Ⅰ,68个基因同时包含Aux/IAA结构域Ⅲ和Ⅳ,21个B6亚组基因包含B3、ARF和Aux/IAA结构域。内含子-外显子结构除了B6亚组基因外,都较为简单。表达模式分析结果显示,不同亚群的基因组织表达特异性不同,同一亚群的基因组织表达特异性一致。Aux/IAA家族基因主要参与细胞组成、蛋白结合、生物进程调节、信号转导、刺激反应、代谢过程等功能。      

烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

腋芽的形成涉及多个调控基因,其中关键基因编码的蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,它的突变或功能缺失将影响腋生分生组织的形成。笔者利用RACE技术克隆了烟草NtLS基因(GenBank登录号EU935581),NtLS与调控植物腋生分生组织形成的基因LS/LAS/MOC1序列高度相似。本研究从该基因上选取干扰片段,构建了含有反向重复序列的RNAi干扰表达载体,并通过农杆菌侵染的方法转染烟草W38,以期为NtLS基因的功能研究奠定基础。     

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

烟草CYP71D亚家族的生物信息学分析

细胞色素P450（CYP450）是一类超基因家族编码的多功能氧化酶,在生物合成、代谢解毒及植物防御方面具有重要作用。其中CYP71D属于CYP450的一个亚家族,主要在次生代谢物合成和病虫害防御方面起作用。为了更好地了解烟草CYP71D亚家族基因特征和功能,本研究利用生物信息学分析手段及烟草转录组数据,对CYP71D亚家族基因的结构和表达等进行了分析。结果发现,在烟草中共有42个CYP71D亚家族成员,各成员在染色体上并非均匀分布,其氨基酸长度和等电点差异较大,但基因结构、保守结构域数目和分布高度一致;二级结构分析表明,烟草CYP71D亚家族成员具备P450蛋白特征结构域;基因表达模式分析显示,多数CYP71D基因在根、叶、花中特异表达,大部分基因参与了IAA激素、黑胫病、温度等逆境胁迫反应。这为烟草CYP71D亚家族基因功能的深入研究及烟草抗逆品种的培育奠定了基础。     

烟草OSCA基因家族鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

高渗门控钙渗透通道(OSCA,hyperosmolal-gatedcalcium-permeable channel)是一种Ca²⁺非选择性阳离子通道,OSCA家族含有钙依赖性通道DUF221结构域。为了进一步了解烟草OSCA基因家族特征和功能,本研究从栽培烟草K326基因组中鉴定到23个OSCA家族基因,并对NtOSCA家族系统进化关系、基因结构与蛋白结构域、启动子、不同组织器官及干旱和盐胁迫下表达模式进行分析。根据进化关系,NtOSCA基因家族被分为4个亚家族,并且同一亚家族成员间蛋白及基因结构相似。启动子分析结果表明,NtOSCA家族基因启动子中存在着多种不同的胁迫响应元件,其中干旱响应元件和脱落酸响应元件较多。进一步组织表达分析结果表明,NtOSCA基因家族成员在不同组织的表达量不同。干旱和盐胁迫表达模式分析表明,20个NtOSCA基因在干旱胁迫下表达量上调,15个NtOSCA基因在盐胁迫下表达量上调。这说明OSCA基因家族在烟草抗旱和抗盐胁迫中具有重要作用。     

烟草Hsp70基因家族的鉴定及NtHsp70Chl基因的表达分析

为探明烟草热激蛋白70（Hsp70）基因家族的特征及烟叶主脉中NtHsp70Chl基因在烘烤条件下的表达模式,对Hsp70基因家族进行了亚细胞定位、系统进化、基因结构、染色体定位,并对NtHsp70Chl基因进行了烘烤条件下实时荧光定量表达PCR分析。结果表明,烟草基因组中Hsp70基因家族共有61个成员,蛋白序列长度不等,等电点在4.52~9.75范围内,各成员蛋白分别定位于细胞质、内质网、细胞外基质、叶绿体和线粒体中;烟草Hsp70基因家族分为6组,定位于叶绿体的成员均存在Ⅵ-a亚组;61个NtHsp70基因分布于18条染色体上,经亚细胞定位于叶绿体的基因分别位于6、17和19号染色体上;烟草Hsp70家族中具有10个基因重复和5个旁系同源基因;经RT-qPCR检测分析,定位于烟草叶绿体中的NtHsp70Chl基因对高温诱导的敏感性较弱。本研究为深入研究烟草Hsp70的功能奠定了基础。     

烟草bZIP基因家族的鉴定及其在不同成熟度烟叶中的表达分析

通过生物信息学方法,从普通烟草中共鉴定了 126个bZIP家族基因.基因结构分析表明:不同成员间外显子数目差异较大,最大达到13个,最少仅为1个.进化分析发现:126个NtbZIP基因被聚为11个亚族,同一亚族中的基因成员大多具有相似的外显子组成.bZIP结构域分析表明:家族成员的核心结构域非常保守,各成员都具有碱性区...