牛源大肠杆菌对喹诺酮类抗生素耐药相关基因的筛选及鉴定

为在大肠杆菌全基因组范围内筛选和鉴定与喹诺酮类抗生素耐药性相关的基因,通过对临床分离的13株大肠杆菌进行药敏试验,选择耐药谱较广泛的菌株作为研究对象,利用Mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,并以亲本菌株为对照筛选文库中对喹诺酮类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变株中转座子的插入位点及其破坏的基因。结果表明:从突变株文库中筛选得到22株分别对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸敏感的突变株,其中7株对4种抗生素都敏感;插入位点分析发现,抗生素敏感突变株中被转座子破坏的基因包括ecs4206(磷酸核酮糖激酶)、ecs3959(β-D-半乳糖苷酶β亚基)、ecs3946(假定蛋白)和ecs1857(DNA结合转录调控因子)。筛选出的基因可被开发为控制或扭转大肠杆菌耐药性的作用靶点。     

瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础.     

源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性与血清型、基因型相关性分析

为了解源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性及其与血清型、基因型的相关性,在前期已鉴定血清型和ERIC基因型的基础上,采用K-B纸片法对21株沙门氏菌分离株进行21种抗生素药物敏感试验,利用PCR技术对耐药菌株进行32种耐药基因检测。结果显示,总耐药率为100%(21/21),耐2种以上抗生素的菌株占76.19%(16/21),多重耐药谱为青霉素-氨苄西林-阿莫西林-链霉素-复方新诺明,其中耐受β-内酰胺类抗生素的类别最多,耐药率最高达100%(21/21)。21株沙门氏菌均检出耐药基因,涉及blaPSE、sul1、strA、blaTEM、sul2、tetA、tetB、aph3-Ⅱa和catⅠ9种,其中blaPSE基因的检出率最高,为85.7%(8/21)。可见源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药性最强,与其携带blaPSE基因有关;耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致;耐药性与具有相同来源的同一血清型、基因型相关。     

鸭源大肠杆菌β-内酰胺类耐药基因的检测

为了解鸭源大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性情况,以及β-内酰胺酶类耐药基因的携带情况,从贵州省三穗县部分规模鸭场的患鸭内脏器官中分离的大肠杆菌中随机选取15株,采用药敏纸片法对其进行8种β-内酰胺类药物敏感试验,采用PCR方法对SHV型、CTX-M型、TEM型β-内酰胺酶类耐药基因进行检测,并对耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对.结果显示,15株鸭源大肠杆菌对8种β-内酰胺类抗生素均存在严重耐药,耐药率高达100％.TEM型和CTX-M型耐药基因均有检出,检出率分别为46.7％和100％,而SHV型耐药基因未检出,其中有7株细菌同时带有两种耐药基因.耐药基因序列比对结果显示,所测菌株序列与数据库中相应耐药基因序列相似性均高达90％以上.     

“乳炎康注射液”消除奶牛乳房炎致病菌对β-内酰胺类耐药性的研究

[目的]研究"乳炎康注射液"对奶牛乳房炎主要致病菌耐药性的消除作用。[方法]观察奶牛乳房炎主要致病菌对氨苄青霉素等5种β-内酰胺类抗生素的耐药性,并通过筛选耐药菌,研究"乳炎康注射液"对其耐药性的消除作用。[结果]奶牛乳房炎主要致病菌对先锋霉素V高敏,对羧苄青霉素比较敏感,对氨苄青霉素、阿莫西林、青霉素G的敏感性低,并且产生了不同程度的耐药性。经"乳炎康注射液"感触后,奶牛乳房炎主要致病菌对β-内酰胺类抗生素的耐药率明显下降,且原来敏感药物的抑菌圈扩大了1.2~2.3 mm。[结论]"乳炎康注射液"对奶牛乳房炎主要致病菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性有一定的消除作用。     

犬源金黄色葡萄球菌临床分离株的耐药性

对宠物门诊分离得到的25株金黄色葡萄球菌进行耐药性分析与β-内酰胺酶测定,以了解近3年来潍坊地区犬源金黄色葡萄球菌的耐药性及其是否产生β-内酰胺酶,以期为临床上致病性金黄色葡萄球菌感染的有效控制提供依据。使用纸片扩散法进行药敏试验;使用碘量法、酚红法测定β-内酰胺酶的产生。25株金黄色葡萄球菌对替考拉宁、利福平、万古霉素十分敏感,对其他25种药物呈现一定耐药性,并对大多数β-内酰胺类抗生素呈现很高的耐药性。碘量法、酚红法测得产β-内酰胺酶的菌株分别为18、17株。产β-内酰胺酶的菌株对万古霉素、利福平、替考拉宁不具有耐药性,对β-内酰胺类抗生素基本具有耐药性;不产酶的菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药性低于产酶菌株。可见,β-内酰胺酶的产生是金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素具有耐药性的主要原因。     

玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库的构建

构建玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库,以期获得丢失玉米赤霉烯酮降解功能的突变子,克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因,阐明MQ01降解玉米赤霉烯酮的分子机制。将携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01中,50℃高温条件下,把穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株MQ01基因组中,获得转座子插入突变的阳性克隆,构建MQ01菌株的突变体文库,随机挑选突变子采用PCR和Southern杂交方法进行验证。本研究成功获得了3 000多个TnYLB-1转座子插入突变的阳性克隆,构建了B.amyloliquefaciens MQ01的突变子文库,结果显示TnYLB-1转座子以单拷贝的形式随机插入到B.amyloliquefaciens MQ01的基因组DNA中,从而可以从转座子突变文库中筛选丢失玉米赤霉烯酮降解功能的转座突变子,从菌株MQ01中克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因。     

一株高拮抗活性菌株的鉴定及其抗菌活性缺失突变体的获得

本研究以黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)和青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)为指示菌,从大豆植物根际土壤中筛选到一株拮抗活性较高的菌株(D-7),经Rec A基因序列分析,鉴定其为新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)。经PCR检测,该菌株不存在毒性基因BCESM(esmR)和cbl A。致病性分析发现该菌株对苜蓿幼苗和洋葱没有致病性。为了解该菌株的抗菌物质合成相关基因,利用Tn5转座子突变法构建菌株D-7的突变体库,并筛选获得10株对黄瓜枯萎病菌抗菌活性减弱的突变体。对各突变株插入位点分析发现,其中5个突变株的Tn5转座子插入到同一基因,该基因编码葡萄糖抑制的分裂蛋白A(Glucose-inhibited division protein A,Gid A),其余5株突变体的插入位点分别位于不同的基因上,编码的蛋白包括糖基转移酶(Glycosyl transferase)、Ⅱ型分泌系统蛋白(typeⅡsecretion system protein)等,表明菌株D-7的抗真菌能力有多个基因参与。     

源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性与血清型、 基因型相关性分析

为了解源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性及其与血清型、基因型的相关性,在前期已鉴定血清型和ERIC基因型的基础上,采用K-B纸片法对21株沙门氏菌分离株进行21种抗生素药物敏感试验,利用PCR技术对耐药菌株进行32种耐药基因检测。结果显示,总耐药率为100%（21/21）,耐2种以上抗生素的菌株占76.19%（16/21）,多重耐药谱为青霉素-氨苄西林-阿莫西林-链霉素-复方新诺明,其中耐受β-内酰胺类抗生素的类别最多,耐药率最高达100%（21/21）。21株沙门氏菌均检出耐药基因,涉及bla_PSE、sul1、strA、bla_TEM、sul2、tetA、tetB、aph3-Ⅱa和catⅠ 9种,其中bla_PSE基因的检出率最高,为85.7%（8/21）。可见源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药性最强,与其携带bla_PSE基因有关;耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致;耐药性与具有相同来源的同一血清型、基因型相关。     

Establishment of Real-Time Ouantitative PCR Method for Determination of Transposon Copy Number in Cronobacter sakazakii

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法.[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值.[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝.[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测.     

独龙牛瘤胃细菌纤维素酶基因克隆

[目的]从分子生物学水平对独龙牛的瘤胃纤维素酶基因资源进行筛选及酶学特性研究,为后续开发利用新的纤维素酶提供参考依据,也为揭示瘤胃微生物降解纤维素的作用机理打下基础.[方法]提取独龙牛瘤胃微生物中的大片段基因组DNA,构建瘤胃微生物基因组文库,并进行纤维素酶活性筛选,筛选获得的高活性基因经测序后进行生物信息学分析与酶学性质研究.[结果]从独龙牛瘤胃中共获得20352个阳性克隆,白斑率达92%,构建的瘤胃微生物基因组文库容量899.6 Mb,空载率1.82%.从瘤胃微生物基因组文库筛选获得2个具有纤维素酶活性的阳性克隆(B1和B2),其中,B1基因序列长1230 bp,编码409个氨基酸,基因编码产物与来自Ruminococcusalbus纤维素酶基因编码产物(β-1,4-内切葡聚糖酶,GenBank登录号P23661.1)的覆盖率高达99%,其同源性高达97%;B2基因序列长1002 bp,编码333个氨基酸,基因编码产物与Unculturedmicroorganism纤维素酶基因编码产物(纤维糊精酶,GenBank登录号ADB80112.1)的覆盖率高达99%,其同源性为83%.B1和B2基因可在Rosetta原核表达宿主菌中成功诱导表达,B1纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40℃;B2纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40~50℃.[结论]从构建的独龙牛瘤胃微生物基因文库中筛选获得2株具有较高活力的纤维素酶(B1和B2),其中,B1为β-1,4-内切葡聚糖酶,而B2为新的纤维糊精酶,可为纤维素的体外降解提供新型材料.     

解淀粉芽孢杆菌Bs-18生防功能相关基因的初步鉴定

本研究利用平板筛选法,从转座子TnYLB-1转化的解淀粉芽孢杆菌Bs-18的突变体文库中筛选到生防作用发生明显变化的3株突变株。以这3株突变株为材料,通过反向PCR技术对突变体中转座子插入位点的侧翼序列进行BLAST比对分析,发现它们与野生芽孢杆菌的芽孢形成、细胞分离、细胞的一系列代谢活动等有关。     

用生物膜干涉技术快速检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留

[目的]采用生物膜干涉技术建立快速检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的方法.[方法]首先通过疏水作用力在APS光线生物传感器探头末端固定氨苄青霉素-BSA偶联物,结合40 nm纳米金标记的β-内酰胺类抗生素受体,建立了检测牛乳中β-内酰胺类抗生素的方法.[结果]生物膜干涉技术检测牛乳中的β-内酰胺类抗生素的灵敏度比胶体金免疫层析试纸条的灵敏度高1倍.该技术还具有良好的特异性,与浓度为1 000 ng/ml的黄曲霉毒素M1、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、泰乐菌素、氯霉素、三聚氰胺无交叉反应.[结论]研究表明,金标记BLI检测β-内酰胺类抗生素的定量范围较小,并不适用于实际生产中的定量检测,但却是一种简便、快捷的定性检测方法,可用于牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的快速检测.     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

湖南地区猪源和鸡源沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

为了了解湖南地区沙门氏菌的耐药表现和基因分布情况,采集了永州、怀化、长沙等地生猪养殖场、屠宰场的猪肛门拭子样本和鸡盲肠样本进行沙门氏菌分离鉴定,并对分离的沙门氏菌进行16种常见兽用抗生素耐药性检测和血清型分析以及β-内酰胺类耐药基因型分析。结果表明:从300份猪肛门拭子样本和170份鸡盲肠样本中总计分离到沙门氏菌69株,血清凝集试验显示其中鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型,69株中的48株为鼠伤寒沙门氏菌;猪源和鸡源沙门氏菌都对四环素、氨苄西林、磺胺异恶唑具有很强的耐药性,耐药率在62%以上,其次为阿莫西林/克拉维酸、氟苯尼考,耐药率在40%左右,未有菌株对乙酰甲喹、安普霉素耐药;多重耐药性结果显示每株菌至少对1种抗生素耐药,最高出现了13重耐药菌株,尚未发现对16种抗生素全部耐药的菌株;β-内酰胺类抗生素常见耐药基因检测结果显示,耐药基因检出率普遍不高,其中Bla CTX-M检出率相对较高,为14.49%(10/69)。这表明湖南省部分地区健康来源动物样品中沙门氏菌检出率相对较高,并有一定的多重耐药情况存在,应保持监测。     

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。     

新疆某猪场猪源耐药大肠杆菌β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶检测及分析

[目的]了解新疆乌市某猪场猪源耐药大肠杆菌携带β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因及其共存情况.[方法]采用PCR方法检测203株β-内酰胺类药物(包括头孢噻呋、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林)多药耐药大肠杆菌进行β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶基因,并测序检出基因的PCR产物.[结果]检出83株菌携带blaTEM (40.89;),2株菌携带blaCTXM(0.99;);检出2株菌携带rmtB(0.99;)基因,并且同时携带blaTEM,未检出其它被检耐药基因.[结论]该猪场猪源大肠杆菌中存在β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶介导的耐药,并且共存.β-内酰胺酶的基因型以blaTEM为主;16S rRNA甲基化酶检出率较低.猪源大肠杆菌存在对头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素多重耐药的风险,有必要对此猪场耐药基因流行情况进行密切监测.     

解淀粉芽胞杆菌SQR9亲缘识别与辨别相关基因的筛选

[目的]依据不同基因突变体的群集运动表型研究解淀粉芽胞杆菌SQR9中参与亲缘识别和辨别过程的关键基因.[方法]利用带有mariner转座元件的穿梭质粒pMarA,构建菌株SQR9的突变体文库,同时结合实验室已保存突变体,通过Swarming平板对峙表型进行筛选,找到与菌株SQR9和FZB42表型发生变化的突变株.针对S...     

副猪嗜血杆菌EZ-Tn5转座子插入突变体库的构建及减毒株的筛选（摘要）

[目的]获得副猪嗜血杆菌减毒株.[方法]应用转座子技术构建转座子插入突变体库,卡那抗性筛选阳性菌株,PCR扩增卡那特异片段去除假阳性,小鼠感染试验检测突变株毒力,并对获得的减毒株进行生物学特性检测。[结果]所获得减毒突变菌株具有与野毒株相似的增殖能力,传代后毒力稳定,遗传学特性稳定。[结论]该研究结果为进一步探讨HPS毒力因子、致病机制奠定了基础。     

利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库

为了鉴定枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长相关基因,用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA转化枯草芽孢杆菌OKB105菌株.高温诱变条件下,筛选了2 000个转座子插入突变的单克隆,构建了OKB105菌株的突变体文库.对随机挑选的15个突变体采用PCR及Southern杂交验证,结果表明:转座子TnYLB-1以单拷贝、随机方式插入到OKB105菌株的染色体上.