弱D72血型的血清学特征及分子生物学分析

目的了解广州地区人群中弱D72血型的血清学特征及分子遗传背景。方法从广州血液中心献血者人群中收集了62人份D变异型标本,采用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术做RHD及RHCE基因分型;对于MLPA检测不到的RHD突变型等位基因,对其10个外显子做直接测序分析,并采用D抗原表位分析试剂盒(DScreen)及其他7种单克隆抗-D做D抗原表位血清学检测。结果在62例D变异型标本中,共发现26例弱D表型,其中弱D72突变型等位基因5例[占8.1%(5/62)],4例为RHD*weak D type 72/RHD*01N.01(RHD基因缺失)和Ccee,1例为RHD*weak D type 72/RHD*DVI.3和CCeee。取1例RHD*weak D type 72/RHD*01N.01的红细胞标本做D抗原表位血清学检测:其与D-Screen试剂盒的9种单克隆抗-D均呈阳性反应,反应强度为1+~2+,与其余7种单克隆抗-D也均呈阳性反应,反应强度为w+~1+。结论血型血清学分析初步提示弱D72血型D抗原表位完整,但该血型个体在免疫刺激下是否不会产生抗-D仍需进一步临床证据证实。     

嘉峪关市RhD阴性汉族人群基因多态性及抗体筛选调查

目的利用分子生物学技术调查分析本地区RhD阴性人群RHD基因的多态性,对RhD阴性个体准确鉴定,制定针对不同个体的临床输血策略。方法招募RhD阴性自愿无偿献血者及患者(以孕产妇为主),经知情同意后,征询调查输血史及女性孕产史,并采集标本进行RhD阴性血清学确认、基因测序和抗体筛选鉴定。结果 96例标本中,检出73例RHD基因全缺失型,18例RHD~*01EL.01基因型,其中RHD1227A纯合型17例,RHD1227A杂合型1例,2例RHD~*15基因型,1例部分D,为RHD~*58基因型,2例RHD~*01N.16变异型。检出产生抗体者4例,其中抗-D阳性2例,抗-D和抗-E均阳性1例,抗-Di~a阳性1例。结论本地区RhD阴性汉族人群中DEL型比例略低于一般汉族人群数据,DEL型女性未见因怀孕或生产多胎D抗原阳性新生儿而产生抗-D或发生RhD-HDN的情况。     

38例血清学弱D表型献血者RhCcEe表型与RHD基因型检测情况分析

目的研究深圳地区血清学弱D表型献血者RhCcEe表型与RHD基因型特点。方法收集38例献血者血液样本,抗-D抗体(IgM/IgG)检测RhD抗原。采用IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e抗体检测RhCcEe抗原。利用PCR-SSP方法分析RHD基因10个外显子,必要时对RHD基因的所有外显子进行直接测序。统计学方法分析RhCcEe表型与RHD基因型之间的相关性。结果 38例血清学弱D表型献血者中发现8种已报道的等位基因,RHD*weak partial 15(15/38)、RHD*DEL1(11/38)、RHD*DVI.3(5/38)、RHD*weak D type 61(1/38)、RHD*weak D type 95(1/38)、RHD*DCC(1/38)、RHD*DFR1(1/38)、RHD*weak D type 50(1/38)、RHD*weak partial 15 / RHD*DEL1杂合(1/38)。其中RHD*weak D type 50在中国汉族人群中首次报道。另外,发现了1例新的RHD等位基因RHD*IVS9-1C(c.1228-1GC)。该等位基因的序列数据已提交GenBank,登记号为MT755965。经相关性分析,RHD*weak partial 15与RhE抗原相关系数为0.727(P0.01),RHD*DEL1与RhC抗原相关系数为0.645(P0.01)。结论深圳地区血清学弱D表型献血者的RHD基因结构呈现多态性,主要为RHD*weak partial 15、RHD*DEL1、RHD*DVI.3,并存在其他稀有的基因型;RHD*weak partial 15与RhE抗原、RHD*DEL1与RhC抗原存在显著正相关。     

广州地区人群中RHD* 960A突变型等位基因的鉴定及血型血清学与分子生物学特征分析

目的分析广州地区人群中RHD*960A突变型等位基因个体的血型血清学与分子生物学特征。方法收集RhD变异型标本,采用2种不同的单克隆抗-D试剂鉴定RhD血型,抗球蛋白凝胶卡法进行直接抗球蛋白试验,并用RhD抗原表位检测试剂盒(D-Screen)检测RhD抗原表位;此外,采用Rh血型分型卡检测Rh CE抗原;采用多重连接酶依赖的探针扩增(MLPA)方法检测RHD及RHCE基因型;对MLPA方法无法给出检测结论的标本,进行RHD基因全部10个外显子的PCR扩增及产物直接测序。结果发现3例RhD变异型标本,直抗阴性,初步血清学结果显示RhD抗原弱阳性表达,RhD抗原表位检测结果显示其红细胞与RhD抗原epD6.6、epD8.2和epD9.1表位特异性单克隆抗体无凝集反应,与其余表位抗体呈弱阳性凝集反应;RHCE抗原分型1例为CCee,其余2例为Ccee;RHD基因的MLPA基因分型显示其基因型为正常的RHD/d(即未鉴定出其携带的突变型RHD等位基因),后续RHD基因外显子直接测序发现其第7外显子携带c.960GA(p.Leu302Leu)同义突变,RHCE基因MLPA基因分型结果与血清学表型一致。结论首次在广州地区人群中发现了RHD*960A突变型等位基因个体,并进行血清学抗原表位和基因型检测,其血清学表现为部分D。     

1 例RHD*weak D type 72 患者的血型鉴定及家系RHD 基因序列分析

目的 研究1 例RhD 血型鉴定部分凝集结果个体及其家系血清学表现和RHD 基因。方法 通过血型微柱凝胶卡检测先证者ABO 及RhD 血型;盐水试管法检测先证者及其父母RhCcEe 抗原;间接抗人球蛋白试验(indirect antihumanglobulin test,IAT) 及流式细胞术检测先证者RhD 抗原。PCR 序列特异性引物(PCR sequence specific primer, PCRSSP)检测RHD 基因以及RhD 杂合型分析,基因测序方法分析RHD 基因编码区序列。结果 血清学检测发现先证者血型为A 型RhCcee,血型微柱凝胶卡、盐水试管法以及IAT 法检测RhD 抗原,结果呈部分凝集现象。流式细胞术结果显示先证者RhD 抗原性减弱。经RHD 基因编码序列分析发现,RHD 基因第9 外显子上的第1212 位碱基发生C ＞A 纯合突变,为RHD*weak D type 72 的特征性突变点。家系调查显示,先证者父亲为O 型RhCCDee,母亲为A 型RhCcDee。父亲携带RHD*weak D type 72 等位基因,基因型为RHD*weak D type 72 / RHD+;母亲一条染色体缺失了全部的RHD 基因,基因型为RHD+/ RHD-。证明先证者分别从父亲和母亲遗传RHD*weak D type 72 和RHD-等位基因,基因型为RHD*weak D type 72 / RHD-。结论 发现了1 例RHD*weak D type 72/RHD-基因型个体,丰富了RHD*weakD type 72 变异型的研究数据。根据家系调查证明,RHD*weak D type 72 等位基因由遗传获得,而非由个体基因变异形成。     

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的 采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型.方法 采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定.提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型.对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析.结果 在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型.其中,127名为RHD基因缺失(占63.5％);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4) -D)及弱D15型(RHD845A)等位基因.在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711 delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD (1-2)-CE (3-9)-D (10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G ＞T,385Gly＞ Val).结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测.也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源.     

RHD~* 1227A等位基因在辽宁汉族Rh阴性人群和随机人群中的频率分析

目的研究调查辽宁地区汉族RHD~*1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率。方法采用吸收放散实验筛查D~(el)表型,RHD基因特异聚合酶链反应-序列特异性(PCR-SSP)筛查RHD~*1227A等位基因,RHD全编码区的核苷酸序列分析方法确认RHD~*1227A等位基因,杂交合子技术检测RHD基因的杂合性。结果在117例Rh阴性献血者中,吸收放散试验检测到24例D~(el)表型,PCR-SSP方法和RHD全编码区测序共检测到23例RHD~*1227A等位基因携带者;23例RHD~*1227A等位基因携带者通过基因测序19例基因型RHD~*1227A/RHD~*01N.01,另外4例基因型是RHD~*1227A/RHD~*1227A纯合。在1 045例随机献血者中检测到11例RHD~*1227A等位基因携带者,9例基因型是RHD~*1227A/RHD~*01,2例基因型是RHD~*1227A/RHD~*01N.01。结论辽宁地区RHD~*1227A等位基因在Rh阴性人群中的频率为0.115 4,在随机人群中的频率为0.005 3。     

RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制研究

目的:探讨RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制。方法:收集2013年1月至2015年10月间经我中心用血清学方法确证的48例RhD变异型孕妇和献血者的血液标本,应用常规血清学方法进行Rh抗原分型后,提取血样DNA,用多重连接依赖探针扩增(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)对入选的48例受检者的RHD进行检测,分析RHD的杂合性和外显子突变情况,并将MLPA检测结果与常规血清学结果进行对比。对比结果不一致的标本进行RHD外显子全长测序,并对其中新发现的等位基因进行克隆测序。结果:48例标本中,CcDee 20例(41.7%)、ccDEe 12例(25%)、CCDee 11例(22.9%)、CcDEe 5例(10.4%)。MLPA检出RHD单条等位基因突变(即杂合性为Dvd型)的38例,其中包含点突变18例、RHD/CE杂交替换20例;涉及两条等位基因突变(即杂合性为DvDv型)的10例,其中包含点突变合并RHD/CE杂交替换9例、碱基缺失合并RHD/CE杂交替换1例。MLPA能够明确其RhD变异型别的有41例(85.4%,41/48),包括弱D15型(845A)等位基因14例、RhDⅥtype 3等位基因22例;7例通过测序分析得以明确。发现2例新的等位基因,分别为79-81del CTC、689GA。结论:CcDee是RhD变异型人群的主要表型,弱D15和RhDⅥtype 3是受检人群的主要RhD变异型,点突变和RHD/CE的杂交替换是主要的分子机制,79-81del CTC和689GA为本研究发现的2个新等位基因。     

100例RhD初筛阴性孕妇D放散型表型筛查及基因型分析

目的对100例Rh D阴性孕妇进行D放散型(Del)表型筛查及基因型分析,同时进行抗体筛查和鉴定,以指导Del血型孕妇的产前监测。方法 2016年2月—2016年11月期间,收集100例多次妊娠且初筛为Rh D阴性的孕妇外周血标本,采用抗球蛋白凝胶卡法检测Rh D血型,抗球蛋白凝胶卡法进行直接抗球蛋白试验;采用Rh血型分型卡检测Rh CE抗原;抗球蛋白凝胶卡法进行不规则抗体筛查及抗体鉴定。采用吸收放散试验进行Del血型表型鉴定,同时采用序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)进行RHD*01EL.01(RHD*1227A)等位基因检测,应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)对Del表型标本RHD基因合子型进行进一步分析;对D变异型标本,进行D抗原表位检测(D-Screen)和RHD基因10个外显子的PCR扩增及直接测序分析。结果 100例标本中检出Del表型27例(27%),均没有产生抗-D,其中21例Rh CE抗原分型为Ccee(77.8%),4例为CCee(14.8%),2例为Cc Ee(7.4%);25例RHD基因型为RHD*01EL.01/01N.01(92.6%),2例RHD*01EL.01/RHD*01EL.01(7.4%)。此外还检出D变异型4例(4%),其中包括2例部分DⅥ3,1例弱D25和1例弱D15,均未产生抗-D。检出Rh D真阴性血型69例,其中产生抗-D 9例(12.7%),且有2例合并抗-C;产生抗-c E合并抗-Jkb1例。结论携带有RHD*01EL.01等位基因的"亚洲型"Del血型孕妇在Rh D阳性胎儿的免疫刺激下,很可能不会产生抗-D,属于完全性Del(complete Del)血型。     

无偿献血者弱D61标本基因分析

目的 对本市献血者中筛查到的1例D^el标本进行基因检测,分析造成其血清学表型的分子基础。方法 献血者EDTA抗凝血分离白膜层提取核酸用于基因分型和外显子编码序列分析,红细胞用于血清学检测,采用试管法和微柱凝胶法做血清学分型,采用基因分型试剂盒做基因分型,通过测序分析基因编码的外显子多态性,确定基因突变的位点或类型。结果 血清学检测结果本例标本RhD表型为D^el,RhCE表型为CCEe,荧光定量PCR结果显示本例标本RHD编码基因外显子均为阳性,排除弱D15和RHD^*DEL1[RHD(1227G>A)],RHD编码基因外显子序列分析结果显示,该标本在外显子编码序列的第28位发生点突变,为弱D61,基因型为RHD^*01 W.61[RHD(28C>T)]。结论 在本市无偿献血者中发现1例弱D61。