利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1（leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法：设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA（sgRNA）,将sgRNA插入载体pCRISPR-LvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成cDNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果：测序结果显示向导RNA（sgRNA）成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的mRNA表达,PAX7 mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的：利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法：选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒（pCMV?tdTomato）共转染原代猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果：分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。     

猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备

目的：从巴马小型猪SALL1的蛋白结构出发,分析其与人SALL1蛋白的同源性,进一步制备Sall1基因敲除的巴马小型猪胎儿成纤维细胞系,为通过体细胞核移植技术获得猪肾脏发育缺陷模型提供实验材料。方法：利用生物信息学方法分析人、猪、鼠 SALL1 的蛋白结构。利用在线设计软件,在猪 Sall1 基因第 1 外显子区域设计单链引导 RNA(single guide RNA, sgRNA)并将其连接至PX330质粒,构建猪Sall1基因敲除打靶载体。在初步转染细胞的基础上,通过Sall1基因测序分析验证 PX330?sgRNA载体打靶效率,最后将打靶载体转染至原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过药物筛选获得单克隆细胞并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明,相比小鼠,猪的SALL1蛋白与人SALL1蛋白具有更高的同源性。成功构建猪Sall1基因敲除打靶载体,并获得33个单克隆细胞系,经基因测序鉴定得到16个Sall1双等位基因敲除的细胞系。结论：生物信息学方法验证了人和猪SALL1蛋白具有更高的同源性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Sall1基因敲除细胞系,为研究Sall1基因在猪肾脏发育过程中的作用提供研究材料,并为下一步获得猪肾脏缺失模型奠定基础。     

GHRHR-SV1抗体的制备及其蛋白在黑色素瘤细胞中的表达

目的：制备生长激素释放激素受体剪接变异体1（GHRHR-SV1）抗体,并检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况,为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法：设计GHRHR-SV1基因序列,将其插入质粒pET-32a（+）中,构建pET-GHRHR-SV1重组载体,经PCR及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0mmol·L^-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）;诱导1、2、4和6 h,并在37℃、30℃和25℃不同温度下进行诱导;观察目的蛋白表达的最佳IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白,将纯化后的蛋白免疫家兔,制备兔多克隆抗体,ELISA法检测该抗体效价,Western blotting法检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系B16-F10中的表达情况。结果：重组载体pET-GHRHR-SV1构建成功。在IPTG浓度为2.0 mmol·L^-1时目的蛋白的表达量最高;IPTG诱导蛋白表达2 h时,蛋白表达量最大;当温度为25℃时,蛋白的表达量最大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后纯度为80%,GHRHR-SV1抗体效价为1：1 600 000,B16-F10细胞中有GHRHR-SV1蛋白表达。结论：成功制备pET-GHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在IPTG浓度为2.0 mmol·L^-1、诱导时间为2 h和温度为25℃的条件下表达最佳。成功制备了高效价的GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有GHRHR-SV1蛋白表达。     

缺失内质网驻留信号肽的小鼠钙网蛋白在B16-F1细胞中的表达

目的：克隆无内质网驻留信号肽的钙网蛋白（CRT）,构建表达分泌性钙网蛋白的B16-F1肿瘤细胞株.方法：以前期构建的小鼠钙网蛋白真核表达质粒为模板,采用突变PCR技术获得无内质网驻留信号肽的钙网蛋白cDNA并克隆入真核表达载体中.以脂质体转染法将该质粒转染B16-F1细胞后,用G418筛选单克隆细胞株.分别以PCR,WesternBlot法鉴定成功转染和表达分泌型CRT的B16-F1细胞株.流式细胞术分析该细胞株的细胞周期.结果：成功获得无内质网驻留信号肽编码序列的小鼠CRT真核表达质粒.稳定转染并筛选出表达分泌性钙网蛋白的B16-F1细胞株,CRT在此细胞株中表达并分泌至培养基质中.稳定转染前后的B16-F1细胞株细胞周期没有明显变化.结论：删除CRT编码序列中内质网驻留信号肽（KDEL）后,CRT失去了驻留在细胞内质网中的能力从而以分泌蛋白的形式出现在细胞外培养基质中.本研究为CRT的细胞外转移提供了一条新的途径,同时为以CRT为基础的抗肿瘤免疫研究提供了新的研究工具.     

PCK1影响肝癌细胞迁移能力的研究

目的：构建编码磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）的基因PCK1重组腺病毒和基因敲除2种细胞模型,并初步观察PCK1过表达和敲除后对肝癌细胞迁移能力的影响。方法：PCK1 cDNA克隆到pAdTrack-TO4载体,构建重组腺病毒质粒,在HEK293细胞中包装、扩增成高滴度重组腺病毒AdPCK1;利用CRISPR/Cas9系统在PLC/PRF/5肝癌细胞系中筛选出PCK1基因敲除的稳定细胞株。首先,在过表达模型将Huh7细胞设为2组：AdGFP组和AdPCK1组,AdGFP组为感染腺病毒AdGFP的对照组,AdPCK1组为感染腺病毒AdPCK1的实验组。在敲除模型设Parental组和KO组,Parental组是PLC/PRF/5细胞作为对照组,KO组是PCK1基因敲除稳定细胞株作为实验组。Western blot技术检测2种模型蛋白表达量,采用划痕实验观察细胞迁移能力,进一步经qRT-PCR检测影响肝癌细胞的迁移关键分子。结果：重组腺病毒AdPCK1构建成功,经Western blot鉴定PCK1在Huh7细胞中的表达。向导RNA（single guide RNA,sgRNA）寡核苷酸双链成功插入酶切后的LentiCRISPR-V2质粒载体中且测序正确;经Western blot鉴定PCK1敲除的细胞株筛选成功。划痕结果显示,PCK1过表达模型在48 h的细胞迁移率为（66.300±0.383）%,与AdGFP组[（42.900±3.833）%]相比明显增加（t=10.540,P=0.000）;PCK1敲除KO组在48 h的细胞迁移率为（59.40±5.68）%,与亲本细胞组[（79.00±5.20）%]相比明显减少（t=4.420,P=0.012）。qRT-PCR结果显示,PCK1过表达后,相较于对照组AdGFP,Cdh1相对表达量为2.733±0.501（t=5.989,P=0.004）,相对表达增高;PCK1敲除后,相较于亲本细胞组,Cdh1相对表达量为0.664±0.017（t=34.290,P=0.000）,相对表达减少。结论：PCK1过表达后可明显抑制肝癌细胞的迁移能力,而敲除后促进其迁移,证实PCK1可能作为抑癌基因参与肝癌的发生和发展。     

Smarcad1重组蛋白表达及多克隆抗体验证

目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程，选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备，并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板，构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白，并纯化。利用蛋白质免疫印迹，蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示，成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中，考马斯亮蓝染色检测，相较于诱导前，加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达，且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明，制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示，相较于对照组，制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性，结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒，利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白，利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白，为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。     

GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2（G protein?coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2）基因敲除的猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）,为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法：采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果：生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论：人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。     

GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立

目的：利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法：设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术（somatic cell nuclear transfer,SCNT）获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中αGal和Sd（a）抗原的表达。结果：成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆 9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其 PBMC无αGal和Sd（a）抗原的表达。结论：CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。     

髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠的构建及应用

目的：通过Cre-loxP基因敲除系统特异性敲除髓系SOCS3基因,构建早期髓系来源抑制细胞（eMDSCs）高浸润荷瘤鼠模型。方法：通过将SOCS3fl/-小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交繁育,获得髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠,PCR法鉴定小鼠基因型,Western印迹验证基因敲除效果,流式细胞术检测髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs比例及其对T细胞的抑制作用,并在该小鼠基础上分别构建乳腺癌、肺癌和黑色素瘤3种eMDSCs高浸润荷瘤鼠模型,流式细胞术检测肿瘤组织中eMDSCs浸润情况。结果：PCR鉴定和Western印迹检测证实髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠构建成功,流式细胞术结果表明髓系SOCS3基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs比例显著升高（t=17.94,P<0.001）,且该群eMDSCs抑制T细胞增殖（t=14.21,P<0.001）、促进T细胞凋亡（t=13.53,P<0.001）。在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌3种髓系特异性SOCS3基因敲除荷瘤鼠的肿瘤组织中eMDSCs数量显著增加（t=24.14、24.56、14.93,均P<0.00...     

基因捕获技术在肝癌侵袭和迁移相关基因筛选中的应用

目的：用基因捕获技术在肝癌细胞SMMC7721细胞中寻找与肝癌侵袭和迁移相关的基因。方法：首先,将pU21质粒转染到肝癌细胞SMMC7721细胞,用G418筛选出单克隆稳定细胞系;其次,采用Transwell小室实验和划痕实验,检测这些单克隆细胞侵袭和迁移能力的变化;最后,用5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测这些细胞系中被pU21质粒捕获的基因。结果：成功获得了约300株稳定转染pU21质粒的单克隆细胞系,得到了约30株侵袭和迁移能力增强的细胞株和约40株侵袭和迁移能力减弱的细胞株。通过5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测,证明了在A554细胞系中,被pU21质粒捕获的基因是long inter-genic non-protein coding RNA 52（LINC00052）。结论：应用基因捕获技术筛选肝癌侵袭和迁移相关基因是可行的。     

基于CRISPR-Cas9系统构建GSTZ1基因敲除模型并探索其对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的：通过CRISPR/Cas9系统在HepG2肝癌细胞系中构建人谷胱甘肽S-转移酶ζ1（glutathione S-transferase zeta,GSTZ1）基因敲除模型并探索GSTZ1敲除对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：设计并合成长度20 bp的靶向GSTZ1的sgRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到LentiCRISPR-V2载体上,与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并感染HepG2细胞,用合适浓度的嘌呤霉素筛选阳性细胞株,有限稀释法获得单克隆细胞。所有实验均分成3组：parental组、KO1组和KO2组,采用MTS实验、克隆形成实验和划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果：Western blot和DNA测序鉴定GSTZ1敲除的单克隆细胞构建成功;MTS检测不同时间点下各组HepG2细胞的增殖能力变化情况。结果显示,48 h时,KO1组[（24.758±1.508）%]相比亲本组[（20.185±0.720）%],增殖能力明显增强,差异有统计学意义（P=0.002）。72 h时,相比亲本组[（23.903±0.840）%],KO1组[（28.634±1.848）%]增殖能力明显增强（P=0.014）。96 h和120 h时,KO1组相比亲本对照组,其增殖能力也明显增强（P<0.05）。在KO2细胞中观察到同样现象,说明敲除GSTZ1后能够促进HepG2细胞的增殖能力。克隆形成实验表明,GSTZ1敲除细胞株（KO1和KO2）克隆形成数（73.330±1.528、82.330±4.163）相比亲本细胞克隆形成数（42.330±2.517）增多,差异有统计学意义（P=0.000,P=0.000）,提示GSTZ1基因敲除可以明显促进肝癌细胞的增殖能力。划痕实验结果显示,GSTZ1敲除细胞株KO1和KO2在48 h的迁移相对比分别为0.327±0.041、0.371±0.013,与亲本细胞（0.184±0.045）相比明显增加（P=0.003,P=0.001）,提示GSTZ1基因敲除可明显促进肝癌细胞的迁移能力。结论：GSTZ1缺失明显促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,提示GSTZ1可能作为抑癌基因调控肝癌的发生和进程。     

TALEN介导的MYH9 基因沉默及对细胞周期与凋亡的影响

目的利用TALEN技术敲除人胃癌细胞系MGC803细胞株MYH9基因,观察MYH9基因沉默后细胞周期及凋亡改变。 方法根据斯丹赛FastTALETM TALEN试剂盒说明书,设计并构建靶向MYH9基因的TALEN质粒对。通过质粒转染、DNA测 序、RT-PCR和Western blot等检测质粒活性,成功挑取MYH9基因敲低单克隆株,并对构建好的细胞株进行周期和凋亡检测。 结果成功挑选的MGC803单克隆细胞株未检测到MYH9基因完全敲除;MYH9基因敲低后,MGC803细胞周期受阻于G2/M 期（P<0.05）,早期凋亡增加（P<0.05）。结论利用TALEN技术成功构建MGC803细胞MYH9基因敲低单克隆株,该模型有助于 后期深入探讨胃癌MYH9基因功能。     

长链非编码 RNA SNHG1对结直肠癌增殖、迁移的影响及调控机制

目的：探讨长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因1 (SNHG1)对结直肠癌（CRC）增殖、迁移的影响及其调控机制。方法：采用实时荧光定量PCR检测人正常结直肠上皮细胞（FHC）、结直肠腺癌细胞系（HT29）细胞中IncRNA SNHG1的表达水平。将HT29细胞分为干扰组（si-SNHG1）和对照组（si-NC）,分别转染SNHG1 siRNA和NC siRNA,采用MTT检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞迁移能力,Western blot检测JAK-STAT信号通路相关蛋白表达。结果：HT29细胞中SNHG1的表达明显高于FHC细胞,差异有统计学意义（t=17.045,P<0.05）;si-SNHGI组细胞增值活性、迁移细胞数均降低,差异有统计学意义（t=16.317、12.714,P<0.05）,STAT3蛋白表达差异无统计学意义（t=1.063,P>0.05）,P-STAT3蛋白表达减少（t=15.473,P<0.05）。结论：SNHG1在CRC细胞中呈高表达,可促进CRC细胞增殖、迁移,其机制可能与SNHG1上调P-STAT3蛋白的表达促进...     

人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法：首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果：生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论：人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。     

利用改良的CRISPR/Cas9n double nick系统构建DPF2基因敲除的人胰腺癌PANC-1细胞株

目的 利用改良的CRISPR/Cas9n double nick系统构建DPF2基因敲除的PANC-1人胰腺癌细胞模型。方法 设计两对靶向DPF2基因第四外显子上下游的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),化学合成sgRNA寡核苷酸序列,并克隆至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin真核表达质粒中。将克隆正确的DPF2-sgRNA重组真核表达质粒与Cas9真核表达载体pST1374-N-NLS-flag-linker-Cas9共转染至PANC-1细胞中,通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选阳性转染细胞,进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株。提取细胞基因组DNA对敲除位点进行聚合酶链反应（PCR）鉴定和测序鉴定。Western blot检测细胞中DPF2蛋白表达情况。结果sgRNA成功插入pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin中且序列正确。PCR扩增鉴定和测序结果表明,PANC-1细胞中一段包括完整第四外显子在内的长度为401 bp的DPF2基因片段被敲除。Western blot检测结果表明,DPF2基因敲除细胞中的DPF2蛋白表达...     

人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC杀伤作用初步研究

目的：探讨人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC的结合和杀伤差异，为猪-人异种肾移植临床应用的供体猪血型选择提供理论依据。方法：抽取20例健康正常人、20例终末肾病患者和20例脑死亡器官捐献者血清，并根据ABO血型分成4组（A血型：n=20;B血型：n=17;AB血型：n=7;O血型：n=16）。用流式细胞术检测4组人血清分别与O血型野生型（WT）、α1、3-半乳糖基转移酶基因敲除（GTKO）、胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶基因敲除（GTKO/β4GalNT2KO）、β1、4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因敲除（GTKO/CMAHKO）和3种基因敲除（TKO/hCD55）猪外周血单个核细胞（PBMC）和红细胞（RBC）的抗体结合或补体依赖的细胞毒性试验（CDC）。结果：A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体IgM和IgG分别对WT猪PBMC,GTKO猪PBMC,GTKO/β4GalNT2KO猪PBMC,GTKO/CMAHKO猪PBMC,TKO/hCD55猪PBMC的结合和杀伤无明显差异。A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体分别对WT猪RBC,GTKO猪RBC...     

CRISPR/Cas9构建TGFBI稳定敲除HSC-3细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除人口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）细胞系HSC-3中的TGFBI基因。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对于TGFBI外显子3上下游的小向导RNA（small guide RNA, sgRNA）,并以PX330质粒为骨架构建能表达此sgRNA的真核重组质粒。将此质粒以及PGK-puro质粒共转染HSC-3细胞,用嘌呤霉素抗性筛选细胞克隆,并用PCR、核酸电泳和测序初步确定基因敲除情况,再通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法确认细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果通过CRISPR/Cas9技术,HSC-3中的TGFBI基因外显子3的核苷酸序列已被完全敲除。免疫印迹法检测显示,相对于HSC-3,TGFBI敲除细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达。同时,通过RT-qPCR对部分基因进行检测,发现一系列与细胞周期和上皮间充质转化相关基因表达发生了改变（P＜0.05）。结论通过CRISPR/Cas9技术成功获得了TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系,为进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制提供了理论基础。     

定量诱导表达PRDM1永久细胞系的建立

目的建立可定量诱导表达PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能创建平台。方法将野生型PRDM1基因的cDNA全长克隆到pMEP4表达质粒中,电穿孔法将pMEP4-PRDM1瞬时转染到细胞系SALT3,经潮霉素B筛选后挑选可增殖的单克隆细胞并大量扩增,在不同浓度的硫酸镉（CdSO4）诱导下检测PRDM1蛋白的表达状况。结果成功构建了pMEP4-PRDM1表达载体,在最佳电穿孔条件下将其转染到SALT3细胞,经潮霉素B筛选后扩增出6个细胞克隆。CdSO4诱导后运用免疫印迹法验证了PRDM1蛋白的表达与诱导剂CdSO4存在量效关系。结论运用pMEP4载体可建立定量诱导表达目的基因PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能奠定了基础。