1株表达人轮状病毒VP7的重组腺病毒的生物学特性鉴定

目的对表达轮状病毒VP7基因的1株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)的生物学特性进行鉴定,为进一步免疫学研究打下基础.方法用rvAdG1VP7(G)感染293细胞,并分别应用电子显微镜技术以及Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法了解rvAdG1VP7(G)的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性.结果电子显微镜观察表明:rvAdG1VP7(G)具有典型的腺病毒形态;Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdG1VP7(G)中确有特异性的VP7基因稳定整合,有较好的遗传稳定性,感染293细胞后能有效转录,可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7.结论 rvAdG1VP7(G)具有良好的生物学性质,为进行体内实验研究提供了必要条件.     

小鼠B7-H4重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasyTM XL system构建携带小鼠B 7-H4基因的重组腺病毒,并鉴定其生物学活性.方法:以RT-PCR方法从C5 7小鼠肺组织中扩增B7-H4全长基因并克隆到T载体,然后测序鉴定.经Xhol Ⅰ和EcoR Ⅴ双 酶切后接入pshuttle-CMV穿梭载体(简称PSC),构建重组腺病毒的穿梭质粒PSC-mB7-H4 ,并电转化至BJ5183-AD-1感受态细菌,经筛选获得携带mB7-H4的重组腺病毒的质粒pmB7 -H4/Ad.将此质粒转化人胚肾细胞(AD-293)产生复制缺陷的重组腺病毒mB7-H4/Ad .以RT-PCR及Western blot方法检测被mB7-H4/Ad感染的AD-293细胞中B7-H4 mRNA和蛋 白的表达,并观察重组腺病毒感染的小鼠成纤维细胞(L929)对T细胞增殖和细胞因子表达的影响. 结果:获得序列准确的mB7-H4基因并成功构建重组腺病毒表达质 粒,转化AD-293细胞获得重组腺病毒;细胞生物学实验证实,该重组腺病毒具有抑制CD3单抗诱导的T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌. 结论:成功构建具有免疫抑制功能的mB7-H4重组腺病毒.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

重组AdPD-L1腺病毒的构建表达及鉴定

目的构建程序性死亡配体-1(PD-L1)重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究.方法酶切含有小鼠全长PD-L1 cDNA的pcDNA3.1/PD-L1质粒,亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细胞内和AdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测,氯化铯密度梯度离心纯化病毒.PCR、Western blot鉴定AdPD-L1感染293细胞后PD-L1的表达,同时进行野生型腺病毒的检测和PD-L1在混合淋巴细胞反应中的作用.结果测序、酶切证实PD-L1基因重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR、Western blot检测AdPD-L1感染的293细胞,均有PD-L1的表达.无野生型腺病毒的产生,PD-L1能显著抑制小鼠混合淋巴增殖反应.结论成功构建了含小鼠PD-L1基因的重组腺病毒载体,这种膜结合性的PD-L1与其相应受体结合后,对T细胞可起到负性调控的作用,为下一步体内基因治疗实验奠定了基础.     

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。方法 将CTLA4Ig cDNA插入腺病毒表达质粒；将重组质粒与病毒基因组质粒共转染293细胞，产生重组腺病毒；采用dot-ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后，以dot-ELISA法筛选到2个293细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑，PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig，为进行器官移植基因治疗研究提供了工具。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE.线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒.结果 RT-PCR反应扩增出1 841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的 基因DMT1-IRE.转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因.结论 携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础.     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7)。方法采用常规分子生物学方法，抽提SD大鼠肝脏总RNA，RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA片段，插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrackCMV-Smad7，线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy-l在细菌BJ5l83内同源重组，鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7。RT-PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况，结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定，与预期结果一致；重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3d可观察GFP明显表达；RT-PCR检测证实Smad7表达增强。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7，为进一步研究TGFl3信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础。     

人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的:克隆人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因并构建其重组腺病毒,观察其在兔BMSc中的表达. 方法:用RT-PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序;将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrack-CMV-BMP-7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定,PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,将AdBMP-7体外感染兔BMSc后,以RT-PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP-7基因的表达. 结果:用RT-PCR方法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因;酶切鉴定表明BMP-7基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功;经293细胞包装3 d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP),氯化铯梯度离心法最终获得约3×109 efu/L滴度的重组病毒;体外感染兔BMSc后RT-PCR方法及荧光显微镜证实BMP-7基因可在兔BMSc中表达. 结论:成功克隆人BMP-7基因并构建其重组腺病毒,证实了其在BMSc的表达,为骨再生的局部基因治疗打下基础.     

沉默信息调节蛋白6基因重组腺病毒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建高表达小鼠沉默信息调节蛋白6(SIRT6)基因的重组腺病毒Ad-SIRT6,并在HepG2细胞中验证其表达。方法:通过PCR获取SIRT6基因编码序列,克隆入pAd-Track-CMV载体质粒中;将重组质粒PmeⅠ线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同电转入大肠杆菌BJ5183中,获得Ad-SIRT6质粒pAd-SIRT6;用PacⅠ线性化处理后,转染Ad293细胞,包装获得Ad-SIRT6。用该病毒感染HepG2,进行RT-PCR及Western blot验证目的基因的表达。结果:pAd-Track-CMV-SIRT6测序结果正确;pAd-SIRT6转染Ad293后,扩增并纯化得Ad-SIRT6;转染HepG2后,经RT-PCR及Western blot验证,可表达外源性SIRT6基因,且SIRT6总蛋白表达量增高(P<0.05)。结论:成功构建可高表达SIRT6基因的Ad-SIRT6,为进一步研究SIRT6基因在肝糖脂代谢中的作用机制奠定了基础。     

Expression and glycosylation of rotavirus strain SA11 VP4 protein in a recombinant adenovirus.

Objective. Using a recombinant human adenovirus to express modified VP4 gene of rotavirus SA11 strain. Methods. A whole VP4 gene was obtained with PCR and induced the signal peptide at the gene N terminal.The chimera gene Was cloned into pCMV plasmid that consists of human cytomegalovirus promoter, and then the gene was cloned to the transfer vector of human adenovirus type 5. Homologous recombination was performed by co-transfection to 293 cell lines with recombinant plasmid and viral genome using CaPO4 precipitation. Results. No mutation was found in the whole VP4 gene sequence of 2362 base pair. The expressed productin recombinant adenovirus was confirmed to be specific and more antigenicity by indirect immunofluorescence as-say. Both the Western blot and immunoprecipitation assay showed that the molecular mass of the expressed protein was higher than the wild type VP4 protein, and that the modified product was corresponding to a glycosyla-tion of VP4 protein. Conclusion. To modify the target gene might be an effective method to enhance the stability, antigenicityand immunogenicity of expressed protein.     

Adenovirus Mediated BIMS Transfer Induces Growth Supression and Apoptosis in Raji Lymphoma Cells

Objective To transfer pro-apoptotic BIM directly into tumor cells bypass the complicated biologica processes of BIM activation so as to reverse the chemoresistance of cancer cells. Methods BIMS was specifically amplified from HL-60 cells by RT-PCR, confirmed to be correct by sequencing and cloned into shuttle vector pAdTrack-CMV carrying a green fluorescence protein gene to generate a recombinant plasmid pAdTrack-CMV-BIMS. This plasmid and adenovirus backbone plasmid pAdEasy-1 were linearized and electroporated into E.coli BJ5183 host bacteria to mediate homologous recombination. The positive clone was identified by restrict endonuclease digestion. The recombinant pAdEasy-CMV-BIMS was transferred into HEK293 cells for packaging and amplification. The successful construction of recombinant human BIMS adenovirus （Ad-BIMS） was demonstrated by Western blot. To test whether Ad-BIMS has the capability of inducing apoptosis of tumor cells, Ad-BIMS was used to infect GC resistant Burkitt lymphoma Raji cells. Results After infected for 2-5 days, BIMS expression in Raji cells was detected by RT-PCR and Western blot. The significant growth retardation and apoptosis of Raji cells were also observed by MTI- and flow cytometry. Conclusion These results indicated that BIMS might be a potential candidate of gene therapy for chemoresistant tumor cells.     

携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体的构建

目的构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础。方法将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his。其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度。结果所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功。测定病毒50%组织培养感染剂量(TCID50)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml。结论成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准。     

EXPRESSION AND GLYCOSYLATION OF ROTAVIRUS STRAIN SA11 VP4 PROTEIN IN A RECOMBINANT ADENOVIRUS

INTRODUCTION Rotavirus (RV) is an unenvelope virus. When the cell is infected, it enters the endoplasmic reticulum by means of budding, and the matured virus will be assembled there (1). The matured virus genome consists of 11 gene segments that code different function proteins. The VP4 and VP7 gene play an important role in inducing the organism to produce the specific immune response. Before the virus is assembled, the VP4 protein is synthesized in cytoplasm and transferred into the …     

重组腺病毒表达轮状病毒SA11毒株VP4蛋白及其糖基化

用重组人腺病毒表达经修饰的轮状态病毒ＶＰ４基因。方法ＲＴ－ＰＣＲ扩增全长ＶＰ４基因,在基因５’末端引入信号肽序列,将带信号肽顺序的ＶＰ４基因插入到含人巨细胞病毒启动子质粒中,然后克隆带巨细胞病毒启动子和信号ＶＰ４基因到人腺病毒５型转移载体上。用同源重组方法共转染２９３细胞,点杂交,酶谱分析筛选重组病毒。     

SLC基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid organ chemokine, SLC)基因的重组腺病毒.方法 采用PCR技术从含有SLC基因的质粒上扩增出SLC基因,将PCR产物酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将SLC基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带SLC基因的重组腺病毒.结果 成功将SLC基因片段克隆至pAd/CMV/V5- DEST载体上,并经293细胞包装出病毒颗粒;经测定病毒滴度为2.6×108 pfu/mL.结论 构建的重组SLC腺病毒可将SLC基因导入肿瘤细胞或组织内,为进一步研究SLC基因的抗肿瘤作用提供了基础.     

人前列腺特异性膜抗原胞外区基因重组腺病毒的构建

目的:体外构建和表达人前列腺特异性膜抗原胞外区(tPSMA)基因重组腺病毒。方法:首先设计一对含BglⅡ和HindⅢ酶切位点的tPSMA引物,以质粒pCR3.1-Uni-hPSMA为模板,通过PCR扩增tPSMA并克隆到腺病毒穿梭质粒中,获得pAdTrack-CMV-tPSMA质粒,将其与含有pAdeasy-1的BJ5183菌电转化,筛选阳性克隆,重组子经线性化后转染HEK293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达、RT-PCR、Western blot法检测目的基因tPSMA的表达。结果:成功构建了含tPSMA的重组腺病毒载体Ad-tPSMA,病毒滴度为2.0×1011pfu/L。结论:该重组腺病毒的构建为下一步研究用其制备树突状细胞疫苗基因治疗提供基础。     

人单纯疱疹病毒1型VP22介导的microdystrophin重组腺病毒的构建及其蛋白转导特性

目的构建含有人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22与人microdystrophin基因融合的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,探讨VP22对microdystrophin基因在成肌细胞中的蛋白转导特性。方法设计引物,从质粒pSIN-rep5-VP22中扩增VP22全长基因,然后将VP22基因定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pCMV-VP22;再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-micro质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入重组质粒pCMV-VP22,获得重组质粒pCMV-VP22-MICDYS。PmeI线性化重组质粒pCMV-VP22-MICDYS,去磷酸化后回收与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组腺病毒。将含VP22-microdystrophin及microdystrophin的病毒上清分别转染成肌细胞C2C12,通过RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学方法检测microdys-trophin的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,Western-blot及免疫组织化学检测显示VP22显著提高了microdystrophin蛋白在C2C12细胞中的表达。结论含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒载体的构建及VP22介导microdystrophin在成肌细胞C2C12间的转导,为利用此病毒进行假肥大型肌营养不良症疾病的治疗研究奠定了基础。