猪链球菌2型致感染性综合征一例

猪链球菌感染是一种人畜共患的急性细菌性传染病，病情发展快，病死率高。本院对1例猪链球菌感染性综合征患者的皮肤瘀斑组织液中分离出血清2型猪链球菌。     

多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用

目的建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌。方法设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法。利用已知菌株,验证方法的特异性和最低检出限。与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性。结果多重PCR方法检测艰难梭菌的最低检出浓度为0．7pg／IM,特异性为100％。53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA＋／tcdB＋为39株．tcdA一／tcdB．为14株。ELISA法检测毒素A／B显示23株为阳性、30株为阴性。23株ELISA法毒素A／B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA十／配拈＋。结论多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值。     

检测胎儿弯曲菌三种亚种的多重PCR方法建立及初步应用

目的 建立一种检测胎儿弯曲菌胎儿亚种、性病亚种和龟亚种的多重PCR检测方法。方法 使用针对胎儿弯曲菌、性病亚种和龟亚种的特异性引物,优化反应体系及反应条件,使用38株菌株（18株胎儿弯曲菌和20株非胎儿弯曲菌）验证其特异性,并将该方法应用于53份爬行动物粪便筛查。结果 针对3种亚种均可扩增相应的片段,胎儿亚种只有1条359 bp大小的条带、性病亚种有2条分别为359 bp和156 bp大小的条带,龟亚种有2条分别为359 bp和266 bp大小的条带。优化后的最佳扩增条件：退火温度58℃,引物MG3f和Cf359r浓度为0.1μmol/L,ISC2mf和ISC2mr、CoA266f和CoA266r的浓度0.2μmol/L。对胎儿亚种、性病亚种和龟亚种的检出限分别为0.40 ng/μL、0.39 ng/μL和0.47 ng/μL。使用18株胎儿弯曲菌和20株非胎儿弯曲菌其特异性为100%。对53份爬行动物粪便进行筛查中有1份龟亚种阳性并分离出了相应的菌株。结论 本研究建立的多重PCR方法能利用1个反应体系同时鉴别3种亚种,从而为菌株快速鉴定、流行病学调查和溯源研究提供技术支持。     

鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

  目的  建立一种鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法,并进行应用效果评价。  方法  选择鼠疫菌染色体YPO0393基因与pMT1质粒caf1基因为靶基因,设计合成YPO0393-内标模板、特异性引物和TaqMan荧光探针,构建鼠疫多重荧光定量PCR内标检测体系;对非鼠疫菌DNA、不同稀释浓度鼠疫菌DNA、野外监测样本进行检测,评价该方法的特异性、灵敏性、重复性和应用效果。  结果  采用多重荧光定量PCR内标方法,8株鼠疫菌DNA均出现明显的扩增曲线,12株非鼠疫菌DNA未显示扩增曲线,提示该方法特异性良好。 不同浓度的鼠疫EV76疫苗株DNA,检测最低限为22.5×10?4 ng/μL,变异系数为0.99～3.42,提示灵敏性、重复性较好。 105份野外监测样本中,荧光定量PCR内标方法检测阳性的6份,与普通PCR方法检测结果一致,4份样本分离培养出鼠疫菌且采用PCR方法检测阳性。  结论  通过设置双靶基因与内标对照,本研究建立的鼠疫多重荧光定量PCR内标方法可降低检测假阳性率,特异性、灵敏性和重复性理想,可用于鼠疫快速检测。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应（PCR）方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白（hilA）基因、变形杆菌溶血素（hpmA）基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用PrimerPremier5．0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401bp、256bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16（4^3）正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为：94．07pg沙门菌DNA,140．85ng变形杆菌DNA,1．41ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4h培养后样品的最低检测限度分别为：沙门菌10^0菌落形成单位（CFU）／mL、变形杆菌10^1CFU／mL、金黄色葡萄球菌10^0CFU／mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白(hilA)基因、变形杆菌溶血素(hpmA)基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用Primer Premier 5.0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401 bp、256 bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为:94.07 pg沙门菌DNA,140.85 ng变形杆菌DNA,1.41 ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4 h培养后样品的最低检测限度分别为:沙门菌100菌落形成单位(CFU)/mL、变形杆菌101CFU/mL、金黄色葡萄球菌100CFU/mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

A型呼吸道合胞病毒荧光定量逆转录PCR检测方法的建立与应用

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，hRSV）是引起婴幼儿冬春季下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一。根据病毒表面糖蛋白的抗原差异，可分为A、B两型，在我国流行的以A型RSV为主。本实验室在建立RSV逆转录（RT）-PCR检测方法的基础上，利用Taqnmn荧光定量PCR技术，建立了A型RSV荧光定量RT-PCR检测方法，有利于RSV的快速诊断和型别鉴定。     

阴道感染三种病原菌多重PCR检测方法的建立及其应用研究

目的 探讨阴道感染病原体多重PCR快速检测白念珠菌、加德纳菌和阴道滴虫的方法建立及其临床应用。方法 根据白念珠菌EO3基因、加德纳菌ITS-23srRNA基因及阴道滴虫TVK3～TVK7基因设计特异性PCR引物,采用加热煮沸裂解法制备DNA模板,进行多重PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测分析,在同一体系内完成三种阴道常见病原体的快速检测。结果 经特异性试验证明所建立的方法能特异地检测出白念珠菌125 bp,加德纳菌433 bp和阴道滴虫300 bp的目的片段,而其它非目的菌株均不能扩增出相应片段; 敏感性试验证实白念珠菌为10 cfu/ml,加德纳菌为10 cfu/ml,阴道滴虫为20 cfu/ml; 对30份已知临床标本和10份模拟混合标本进行检测均可检测出相应的病原体。结论 实验证明该研究所建立的白念珠菌、加德纳菌和阴道滴虫的多重PCR体系,具有灵敏度高、特异度强,可一步同时检测阴道分泌物中三种病原体,用于阴道感染的早期快速诊断。     

呼吸道合胞病毒A与B亚型多重荧光PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种新的呼吸道合胞病毒(RSV)分型检测方法,用于快速检测和监测。方法针对RSV G基因设计引物、探针,并引入人β-actin基因(ACTB)作为内参质控,建立RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法。使用多种常用呼吸道病原体及体外转录RNA产物考核其特异性和灵敏度。并对2015年1月至12月广州两家医院的儿童急性呼吸道感染患者进行检测。结果所建立的多重检测方法未见非特异性反应。RSV-A、RSV-B和ACTB分别可检测低至4、8和12 copies/μL的RNA模板,且分别在10~1×10~(10)copies/μL、100~1×10~(10)copies/μL和100~1×10~(10)copies/μL时具备良好的线性关系,线性相关系数r2均大于0.99。儿童急性呼吸道感染患者监测中,RSV-A为期间优势亚型。结论本研究所建立的RSV-A、RSV-B多重荧光PCR检测方法,具有较好的特异性、灵敏度、可操作性,可用于相关研究。     

基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因检测方法的建立与评价

目的 基于多重聚合酶链反应（PCR）建立一种快速方便的检测副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的方法。方法 结合副溶血弧菌大流行菌群的群特异鉴定方法GS-PCR,与副溶血弧菌致病相关的耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh）序列设计引物,建立并优化多重PCR检测方法。用已知的大流行菌株和非大流行临床分离株,对其进行特异性、灵敏度等性能的评价。并对224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行了再鉴定。结果 副溶血弧菌大流行菌群有群特异PCR标识基因和tdh扩增条带。而其他细菌扩增结果呈阴性。检测灵敏度可达到105 CFU/ml。对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株进行再鉴定表明,其中5株为副溶血弧菌大流行菌群,其中3株为tdh阳性、trh阴性,2株tdh、trh均阴性。结论 本研究所建立的多重PCR方法特异性好、灵敏度高。为副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的快速大规模检测提供良好的技术支持。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株荧光定量PCR检测方法的建立

目的应用荧光定量PCR技术实现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的快速鉴定。方法利用所报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株Nsp2基因片段设计引物和探针,并对该方法进行特异度、灵敏度、重复性等方面的考察。结果用该方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的近源种未发生非特异性扩增,最低检出浓度为1.0×103copy/mL。结论用该荧光定量PCR检测方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株不仅特异度好、灵敏度高,且快速简便。     

琼脂糖凝胶电泳与核酸印迹杂交法检测细菌毒力基因PCR产物的灵敏度比较研究

目的 探讨核酸印迹杂交法在检测细菌毒力基因方面的应用价值。 方法 分别以10倍连续稀释的O157 ∶ H7肠出血性大肠埃希菌和血清2型猪链球菌染色体提取物为模板,与志贺毒素2基因(stx2)和荚膜多糖2J基因(cps2J)特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)。用1%琼脂糖凝胶电泳及核酸印迹杂交法检测PCR产物,比较两种方法的最低检测限。 结果 1%琼脂糖凝胶电泳对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.7102 cfu(56.87 pg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为 4.3102 cfu(12.65 pg)/PCR体系;核酸印迹杂交法对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.710-1 cfu(56.87 fg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为4.310-1 cfu(12.65 fg)/PCR体系。 结论 用核酸印迹杂交法检测肠出血性大肠埃希菌stx2基因和猪链球菌cps2J基因PCR产物的灵敏度均比普通琼脂糖凝胶电泳检测法高了1000倍。     

不同人类免疫缺陷病毒2型检测方法的比较研究

目的通过随访调查16例人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2）可疑感染者，初步评价HIV一2的几种检测方法。方法从贵州省采集既往经HIV-1／2免疫印迹（WB）试验检测出现HIV-2指示带的16份受检者的全血样品，进行HIV-2抗体和核酸检测。血浆中的抗体用HIV-1／2ELISA初筛一复检，其中阳性样品再分别用HIV-1／2线性免疫试验（LIA）和HIV-2WB检测。外周血单核细胞（PBMC）中的前病毒DNA用HIV-2巢式PCR检测。结果16份血浆样品经HIV-1／2ELISA筛查均为HIV抗体阳性；用HIV-1／2 LIA检测，全部为HIV-1抗体阳性，15份为HIV-2抗体阴性、1份不确定；用HIV-2WB检测，有3份为HIV-2抗体阳性、13份不确定。由于这批样品的采样时间距首次检测至少1年以上，可以排除窗口期感染，上述检测结果不确定的受检者均可判为HIV-2抗体阴性。此外，用巢式PCR检测所有PBMC样品均为HIV一2核酸阴性。结论16例受检者全部为HIV-1而非HIV-2感染，HIV-1／2uA的抗体检测结果与HIV-2核酸检测结果基本相符，而HIV-2WB则产生了大量的不确定甚至假阳性结果。     

2型糖尿病患者超敏C反应蛋白和血脂检测的临床应用

目的：探讨血清超敏C反应蛋白（hs-CRP）与血脂联合检测在2型糖尿病及其血管并发症中的应用。方法：用日立7600-110全自动生化分析仪和Beckman Immage测定35例2型糖尿病患者、40例冠心病患者、30例2型糖尿病并发冠心病患者和45例体检健康者血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和hs-CRP水平。结果：3个疾病组hs-CRP水平及血脂各项（TC、TG、LDL-C）均比健康对照组高,差异有统计学意义（P〈0.05）,2型糖尿病组与冠心病组比较差异无统计学意义;3个疾病组HDL-C比健康对照组低,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：hs-CRP作为一个炎症因子,在预测糖尿病及其并发心血管疾病中具有重要的临床意义;2型糖尿病患者常伴有血脂紊乱,与hs-CRP联合应用能判断患者动脉粥样硬化的危险性。     

多重实时荧光定量PCR方法在高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测中的应用

摘要：目的?建立一种基于多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)技术的可同时检测14种高危亚型人乳头瘤病毒(HPV16、18、31、33、35、39、52、45、51、56、58、59、66、68)癌基因E6/E7 mRNA的方法。方法?对14种高危型HPV各自的E6/E7基因序列区域设计特异性引物和探针，配以优化的反应体系，形成HPV E6/E7 mRNA检测体系，评价方法检出限、特异性。收集223例临床样本，分别用自建的一步法MRT-PCR法与转录介导等温核酸扩增(TMA)技术(Aptima?HPV试剂盒)检测HPV E6/E7 mRNA，同时评估HPV E6/E7 mRNA检测结果与薄层液基细胞学检测、宫颈组织病理学检测结果的一致性。结果?建立的检测方法对常见的低危型HPV无交叉检出，且对14种高危型HPV的检测限可达10～100 copies/μL。该方法检测223例临床标本的结果与Aptima??HPV检测结果相比，一致性较好(Kappa=0.910)。以组织病理结果为CINⅡ及以上的作为阳性，MRT-PCR法临床检测敏感性为84.0%，特异性为94.4%，阳性预测值为65.6%，阴性预测值为97.9%。结论?建立的MRT-PCR方法具有特异性好、灵敏度高和稳定性好等优点，为HPV临床快速检测以及宫颈病变筛查提供了一个有效的技术平台。     

荧光定量聚合酶链反应检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-1方法的建立

目的　构建含有金属蛋白酶组织抑制因子- 1(TIMP -1)的重组质粒并以其为模板建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测TIMP- 1的标准曲线,为荧光定量PCR准确检测TIMP- 1奠定基础。方法　提取大鼠星状细胞系HSC -T6的mRNA,经RT- PCR扩增TIMP- 1基因后与pGMT Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,以筛选得到的阳性克隆质粒作为标准品进行梯度稀释,分别用Taqman荧光探针技术和SYBRGreenI荧光染料技术进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对两者结果进行了对比。同时进行普通PCR检测,与荧光定量PCR方法检测结果进行比较。结果　重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明pGMT- TIMP- 1基因已成功克隆。以不同稀释水平的标准品质粒进行荧光定量PCR扩增, 应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线的线性检测范围为7×104 ~7×108 拷贝,检测灵敏度为7×104 拷贝;应用SYBRGreenI荧光染料技术的线性检测范围为7×106 ~7×108拷贝,检测灵敏度为7×106 拷贝,且熔解曲线显示出现非特异性扩增;两种技术相对于普通PCR技术均具有定量功能。结论　所构建的pGMT- TIMP -1基因荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好, 灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为荧光定量PCR检测TIMP -1基因的标准方法。     

炎症因子与2型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度的关系

目的 探讨炎症因子与2型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度(IMT)的关系.方法 50例2型糖尿病患者,根据胰岛素抵抗指数分为胰岛素抵抗组(IR组)26例及非胰岛素抵抗组(NIR组)24例,同时选取24名健康体检者为对照组.3组患者均行超声检查颈动脉IMT,测定空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、血脂、超敏C反应蛋白(hs-CRP)及肿瘤坏死因子(TNF-α)等指标,采用自我平衡模型分析法(HOMA)计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR).结果 对照组、NIR组及IR组患者的HOMA-IR、hs-CRP、TNF-α及IMT水平均逐渐增加,且3组间比较差异均有统计学意义[HOMA-IR:1.74±0.49、2.24±0.41、4.89±0.84(F=190.228,P＜0.01);hs-CRP:(1.75±0.83)、(3.08±1.04)、(5.89±1.17) mg/L(F=106.523,P＜0.01);TNF-α:(15.25±7.64)、(23.38±8.82)、(47.42±9.97) rng/L,(F=89.210,P＜0.01);IMT:(0.69 ±0.31)、(1.07 ±0.32)、(1.49±0.43) mm(F=30.942,P＜0.01)];相关性分析显示hs-CRP水平与HOMA-IR、IMT水平呈正相关(r值分别为0.453、0.395,P均＜0.05),TNF-α水平与HOMA-IR、IMT水平呈正相关(r值分别为0.428、0.376,P均＜0.05),HOMA-IR水平与IMT水平呈正相关(r =0.403,P＜0.05).结论 2型糖尿病患者存在炎症反应,并与胰岛素抵抗密切相关,炎症因子与胰岛素抵抗在2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化的发生、发展过程中起着重要的作用.     

多重PCR快速检测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者骨髓BCL2/IGH与BCL6/IGH融合基因的临床意义

弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤,其临床表现、分子生物学特点都有显著的异质性。本研究旨在探讨多重PCR技术在DLBCL患者骨髓BCL2／IGH及BCL6／IGH等融合基因检测中的临床意义。利用多重巢式PCR技术对80例初治DLBCL患者的骨髓标本进行BCL2／IGH及BCL6／IGH融合基因检测。结果表明,80例患者骨髓标本中携带目的融合基因共12例,阳性率为15％;其中BCL2-IGH阳性患者为6例,BCL6-IGH阳性患者为6例。DLBCL患者携带不同的融合基因具有不同的临床特点。结论：运用多重PCR方法对DLBCL患者进行分子生物学检测具有快速、准确的优点。但需进一步深入研究改善方法,使之对融合基因能做定量或半定量分析,这对于DLBCL患者的诊断、协助分期、预后评估、微小残留病变的估测,指导临床治疗DLBCL有重要意义。     

2型糖尿病患者血清炎症因子与胰岛素抵抗的关系

目的观察2型糖尿病（T2DM）患者高敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）与胰岛素抵抗（IR）的相关关系。方法选择正常对照组80例，T2DM患者162例；将T2DM分为A、B组：A组为单纯T2DM患者组81例、B组为T2DM大血管病变组81例；测定各组血清hs—CRP、IL-6、TNF-α水平。并计算胰岛素抵抗指数（HOMA—IR）。结果T2DM的hs—CRP、IL-6、TNF-α、IR水平明显高于正常对照组。T2DM大血管病变组的hs—CRP、IL-6、TNF-α、IR水平均明显高于单纯T2DM患者组。T2DM组患者hs—CRP、IL-6、TNF-α与IR均呈正相关。结论炎性反应与胰岛素抵抗同步存在，而且与糖尿病及并发症发生密切相关，炎症因子能较好的反映糖尿病患者的病情和胰岛素抵抗程序。