兔颞下颌关节盘纤维软骨细胞分离培养的实验研究

 【目的】探讨颞下颌关节盘纤维软骨细胞的分离及体外扩增的条件，观察关节盘纤维软骨细胞体外培养的生物学特性。【方法】在无菌条件下，切取2周龄新西兰白兔颞下颌关节盘，剪至1．0m^3的碎块，0．5g／mL胰酶消化30min、胶原酶消化4h，200目筛网过滤，获得关节盘纤维软骨细胞。在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化及贴壁率，甲苯胺蓝染色、、胶原免疫组化染色鉴定，测定其生长曲线。透射电镜观察细胞超微结构。【结果】原代培养的关节盘纤维软骨细胞12h可观察到贴壁细胞，48h贴壁细胞逐渐增多，大部分细胞为短梭形，小部分为多角形，第4天可见多个细胞克隆形成，第8天时细胞彼此相连，铺满平底，细胞以梭形为主，部分多角形。传代后12h贴壁率达90％，大部分为多角形，4～5d即可张满瓶底。甲苯胺蓝染色可见异染颗粒，胶原免疫组化染色胞浆内可见棕黄色颗粒。细胞内线粒体、内质网发达、高尔基体发达。【结论】体外分离培养的兔颞下颌关节盘纤维软骨细胞具有较强的增殖能力。     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.     

软骨细胞体外分离培养与鉴定的实验研究

目的探讨兔关节软骨细胞分离、培养和鉴定的方法，建立软骨细胞的体外培养体系。方法4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法，分离膝关节软骨细胞接种培养以及传代培养．倒置相差显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定。结果成功建立了体外培养软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性。细胞传至5代后．出现“成纤维细胞样”。结论本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法；初代、第2代、第3代细胞生长良好，适合于实验研究；软骨细胞5代培养后．细胞袁型发生改变。     

BMP-2诱导肌源性干细胞转化为软骨样细胞的体外实验研究

目的 体外定向诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)向软骨细胞转化,并对诱导细胞进行鉴定.方法 用差速贴壁的方法对SD大鼠MDSCs进行分离和培养.用骨形态发生蛋白2(BMP2)将MDSCs进行诱导分化,9 d后取出标本,行甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.RT-PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的mRNA表达.结果 5 d后镜下见细胞形态由梭形向多边多角形转化.9 d后诱导组甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.结论 BMP-2可诱导MDSC向软骨细胞转化.     

胰岛素样生长因子Ⅰ与透明质酸对人胚关节软骨细胞表型的影响

【目的】研究胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )和透明质酸 (HA)联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响 ,判断其稳定软骨细胞表型的效果。【方法】分离培养人关节软骨细胞 ,从第 4代开始 ,用hIGF Ⅰ和HA联合培养 ,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化及RT PCR判断联合培养第 8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第 6代细胞为对照组。【结果】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡 ;RT PCR显示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性而Ⅰ型胶原mRNA表达阴性 ;甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒 ;Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化见 80 %～ 92 %的细胞染色呈阳性或强阳性 ,平均灰度分别为 85 92和 116 2 3,均显著低于对照组 ,说明处理组染色较对照组增强。【结论】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型 ,为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。     

兔关节软骨细胞的分离、培养和形态学特征

[目的]探讨兔关节软骨细胞的分离、培养方法,观察单层高浓度培养时细胞表型表达情况.[方法]无菌条件下,从 2周龄新西兰白兔的颞颌关节及四肢关节髁突面削取软骨片,采用机械-酶消化法分离软骨细胞,经台盼蓝拒染计数,将细胞按 1× 106个 /孔接种于 6孔培养板,传代培养,描绘生长曲线.利用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态.应用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定.[结果]每克软骨能获取 1 5× 106个软骨细胞,活性率为 95%.培养 2～ 3 d,细胞贴壁、变形,呈多角形; 8 d左右,细胞融合成层.透射电镜观察显示细胞核圆形,有丰富的粗面内质网、高尔基体及分泌的基质成分.甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性.细胞传至 5代后,出现"成纤维细胞样".[结论]本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法;初代、第 2代细胞生长良好,适合于实验研究;软骨细胞 5代培养后,细胞表型发生改变.     

颞下颌关节骨关节病髁状突软骨细胞体外培养及细胞生物学特性研究

目的:从兔的颞下颌关节骨关节病模型动物获得髁状突软骨细胞并行体外培养.方法:采用部分关节盘手术切除的方法制造颞下颌关节骨关节病模型,组织大体观察、超微结构观察和组化检测方法确定骨关节病的存在.在此基础上,通过机械分离、胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法从骨关节病髁状突软骨组织中获得软骨细胞,进行体外环境下的贴壁培养;通过软骨细胞特异性蛋白的免疫组化方法进行细胞鉴定.四甲基偶氮唑盐法比较病理模型细胞与正常细胞的增殖能力差异.结果:上述颞下颌关节骨关节病模型全面地模拟了骨关节病变关节软骨组织的特征;利用机械分离、胰蛋白酶胶原酶联合消化的方法成功地从骨关节病髁状突软骨组织中分离出软骨细胞并在体外贴壁条件下培养成活;应用特异性的Ⅱ型胶原多克隆抗体和聚合性糖胺多糖单克隆抗体对培养细胞进行免疫组化检测鉴定,均显示阳性.骨关节病髁状突软骨细胞的增殖能力高于正常细胞.结论:成功地建立了骨关节病髁状突软骨细胞的体外模型;骨关节病早期的髁状突软骨细胞表现出增殖活跃的特性.     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞。构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养，以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况；应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果 永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长，长期传代(50代)仍有很强的增殖能力，形态呈现多角形和三角形，GAG和胶原染色均呈阳性。结论 构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

不同年龄兔软骨细胞培养和形态学研究

目的：研究兔关节软骨细胞的寸离、培养方法，观察不同年龄兔软骨细胞的形态学特性。方法：无菌条件下，从不同年龄新西兰白兔的四肢关节髁突面削取软骨片，采用机械-酶消化法分离软骨细胞，经台盼蓝拒染计数，传代培养。应用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定，利用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态，激光共聚焦扫描显微镜检测软骨细胞直径。结果：培养2d～3d，细胞贴壁、变形，呈多角形；8d左右，细胞融合成层。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性。透射电镜观察显示，随兔年龄改变，关节软骨细胞的超微结构也有所差异。用激光扫描共聚焦显微镜对其直径进行检测，显示三组细胞的直径两两之间都有差别，即成年软骨细胞直径大于幼年软骨细胞直径，小于老年软骨细胞直径（P〈0．001）。结论：本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法；初代、第2代细胞生长良好，适合于实验研究；不同年龄兔软骨细胞的形态结构有所改变，为了解骨性关节炎的发展变化提供一定依据。     

乳鼠软骨细胞体外培养及生物学特性研究

目的:研究体外培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞的原代培养方法,探讨该方法应用的可行性和应用价值.方法:采用胶原酶消化法分离培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞,以含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液进行培养,并进行细胞接种与传代,用倒置显微镜、电镜及组织学方法观察细胞形态、超微结构.细胞采用ABC法进行Ⅱ型胶原免疫组化染色以及细胞形态观察鉴定软骨细胞起源.结果:(1)原代培养软骨细胞48 h后,大量细胞贴壁生长,呈圆形、长梭形或有2～3个突起,胞质透亮、饱满,7 d后细胞铺满整个培养皿底面.(2)原代软骨细胞呈圆形或多角形,第4代有一半变成梭形,第5代绝大部分变为长梭形;原代软骨细胞胞浆内粗面内质网和线粒体丰富,第3代软骨细胞生长增殖能力强于原代,第5代增殖能力明显减弱.结论:体外培养的乳鼠剑突软骨细胞保持了其体内的基本特征,采用胶原酶消化法分离培养软骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法.第3代软骨细胞适合用于软骨组织工程及学术研究.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

阴道炎1236例病原检查分析

对１２３６例阴道炎患者的阴道分泌物作直接镜检和病原菌分离培养检查；结果，细菌感染９００例，念珠菌２３４例，滴虫１０２例。９００例细菌经鉴定；葡萄球菌３００例，阴道加特纳菌２７６例，淋病奈瑟菌１７０例，其它细菌１２４例。结果表明，葡萄球菌，阴道加特纳菌，淋病奈瑟菌是细菌性阴道炎最常见的致病菌。     

碱量法测定壳多糖脱乙酰度的方法探讨

目的：评价壳多糖脱乙酰度测定的减量法的影响因素。方法：通过实验评价碱量法的精准度及样本含潮量等因素对测定结果的影响,并对汪氏推荐计算公式和本文作者提出的改良公式作出评价。结果：碱量法测定壳多糖脱乙酰度受样本性状、含潮率、反应体系中酸量的影响。改良公式更能反映样本实际脱乙酰度。结论：碱量法简便易行,评价指标在可接受范围,可用于壳多糖研制中的质量评价。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点,诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据,做出准确诊断,给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂,腹腔内疾病占64．63％,共17种病因;腹腔外疾病占35．37％,共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查,在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。     

手术治疗髋臼骨折45例效果观察

目的:探讨髋臼骨折患者的手术治疗效果。方法:系统性回顾收治的45例髋臼骨折患者手术治疗效果。结果:本组患者随访2～8年,治疗的总优、良患者38例,总优良率达到84%,手术切口全部愈合,未发生切口感染及深部感染,在患者中5例出现并发症:1例坐骨神经损伤,1例股骨头坏死,1例异位骨化,2例创伤性关节炎。结论:充分的术前计划,恰当的手术时机,正确的入路选择以及良好的术后锻炼,是治疗髋臼骨折的有效方法。     

癫痫常见临床误诊原因分析

目的通过对癫痫和非癫痫误诊病例及24小时脑电图确诊癫痫患者的临床特点分析,提高癫痫的诊断率,减少癫痫误诊。方法纳入四川大学华西医院2009年10月～2011年4月收治的误诊病例及经脑电图确诊的癫痫患者共172例,分析其误诊原因和临床特点。结果在纳入的172例患者中99例非痫性发作误诊为癫痫发作,43例癫痫发作误诊为非痫性发作,30例经24小时脑电图确诊为癫痫。癫痫最易被误诊为短暂性脑缺血发作(TIA)、晕厥、假性发作。反之,非癫痫发作误诊癫痫发作多见于假性发作、TIA。对24小时脑电图确诊的癫痫发作患者的临床特点分析发现不自主咂嘴合并吞咽动作、上腹部不适是最常见待诊患者的临床表现。结论熟练掌握癫痫与非癫痫发作性疾病的临床表现,仔细询问病史,认真做好体格检查,结合脑电图尤其是24小时视频脑电图等检查进行综合分析,可以减少癫痫的误诊,提高癫痫的诊断率。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。