黄连素对脂多糖诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用研究

目的探讨黄连素（BBR）对脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）损伤的保护作用及其机制。方法体外培养HUVECs,分为正常对照组(Control组)、LPS组、LPS+细胞自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）组、LPS+细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）组和LPS+BBR组,置于含相关药物的培养基中继续培养。采用EdU染色法检测细胞活性变化,荧光显微镜观察自噬流变化,Westernblot法检测自噬相关蛋白p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平变化。结果与Control组比较,LPS组EdU染色阳性细胞率明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;与LPS组比较,LPS+RAPA组EdU染色阳性细胞率明显下降,而LPS+3-MA组EdU染色阳性细胞率明显上升,LPS+BBR组EdU染色阳性细胞率明显上升,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Control组比较,LPS组自噬小体和自噬溶酶体数量均增加,p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平均上升（均P＜0.05）;与LPS组比较,BBR组自噬小体和自噬溶酶体数量均减少,p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平均下降（均P＜0.05）。结论LPS诱导HUVECs产生自噬,BBR通过抑制由LPS诱导产生的自噬来减轻LPS诱导的HUVECs损伤。     

法舒地尔对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

目的:观察法舒地尔对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的影响,探讨其作用机制.方法:用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化分离HUVECs,加入内皮细胞完全培养基中培养,采用胰蛋白酶进行消化传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并进行免疫组织化学鉴定.将HUVECs随机分为对照组(内皮细胞培养基培养)、LPS组(内皮细胞培养基+0.1 μg/mL LPS)和法舒地尔组(内皮细胞培养基+0.1 μg/mL LPS+3.275 μg/mL法舒地尔),Western blot法检测RhoA、ROCK2、p-ERM蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测RhoA、ROCK2和p-ERM mRNA表达量.结果:原代培养的内皮细胞在接种后24 h后完全贴壁生长,第3天融合呈铺路石样镶嵌排列,免疫组织化学检测可见第Ⅷ因子相关抗原阳性反应,证实为内皮细胞.LPS组RhoA、ROCK2和p-ERM蛋白及基因表达水平均显著高于对照组(P<0.01);而法舒地尔组ROCK2和p-ERM蛋白及基因表达均低于LPS组(P<0.05~P<0.01),但2组RhoA蛋白和基因表达水平差异均无统计学意义(P>0.05).结论:Rho/ROCK/ERM通路在LPS诱导的HUVECs细胞骨架改变中起重要作用,法舒地尔可拮抗LPS诱导的骨架蛋白重排等HUVECs损伤,其机制可能与抑制Rho/ROCK信号通路活化有关.     

低氧抑制人脐静脉血管内皮细胞miR-26a的表达

目的 观察低氧对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）miR-26a及PTEN/AKT/VEGF通路相关因子表达的影响。方法 分常氧组和低氧组培养48h。荧光定量RT-PCR和Western blot法检测miR-26a及PTEN/AKT/VEGF通路相关因子的表达。结果 RT-PCR结果显示低氧组HUVEC中miR-26a和PTEN的相对表达量为0.42±0.02和0.62±0.03,显著低于常氧组的1.00±0.34和1.00±0.35（P<0.05）。Western blot法检测结果显示,与常氧组相比,乏氧组HIF-1、VEGF和AKT蛋白表达明显升高,PTEN 蛋白明显降低（P<0.05）。结论 低氧抑制HUVEC miR-26a的表达并继发下游PTEN/AKT/VEGF因子的序贯反应,可作为创面改善缺血状态治疗的新靶点。     

姜黄素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症反应的影响及分子机制

目的 研究姜黄素对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症因子表达的影响,初步探讨可能的分子机制.方法 使用LPS(1μg)和姜黄素(5μmol/L、15μmol/L或30μmol/L)处理HUVEC细胞24 h,收集细胞总RNA,实时定量PCR(RT-PCR)和ELISA方法检测细胞TNF-α、MCP-1水平;Western blot检测细胞TLR4、MAPKs、NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκBα的表达情况.结果 与空白对照组比较,姜黄素能显著抑制LPS诱导HUVEC细胞TNF-α、MCP-1和TLR4的过表达(P<0.05),明显降低NF-κB p65和MAPKs的磷酸化及IκBα蛋白降解(P<0.05).结论 姜黄素可能基于抑制TLR4/NF-κB,从而影响LPS诱导HUVEC细胞炎症因子的表达.     

辛伐他汀对脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞Tribbles表达的影响

目的 研究脂多糖(LPS)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)肿瘤坏死因子(TNF-α)和Tribbles mRNA表达变化及辛伐他汀对其表达的影响.方法 实验分为12h组和24h组,各组又分为空白对照组、脂多糖(100ng/ml)组、辛伐他汀(5 μg/ml)组、辛伐他汀(5 μg/ml)和脂多糖(100ng/ml)共...     

槲皮素对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞AKT/mTOR信号通路及自噬的影响

目的：分析槲皮素对人脐静脉内皮细胞自噬和增殖的影响,探讨其与AKT/mTOR信号通路调控的关系及机制。方法：培养人脐静脉内皮细胞,MTT法检测细胞活力,MDC染色法检测自噬泡水平,Western印迹检测自噬相关蛋白水平,运用3-MA研究槲皮素对自噬和细胞增殖的影响。结果：槲皮素能增加人脐静脉内皮细胞活力(P<0.01),上调细胞中MDC染色标记的荧光颗粒,并伴随浓度的上调明显增加(P<0.01),能促进脐静脉内皮细胞中自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平表达(P<0.01),降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.01)。与槲皮素组比较,槲皮素+3-MA组细胞活力和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均明显降低(P<0.05),p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.05)。结论：槲皮素可通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬来调控脐静脉内皮细胞增殖。     

血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞凋亡

目的 探讨AngⅡ诱导人血管内皮细胞Ⅱ凋亡的作用及其机制.方法 原代培养人脐静脉血管内皮细胞,用不同浓度AngⅡ及神经酰胺合成酶抑制剂烟曲霉素B1(fumonisin B1,FB1)处理细胞,采用TUNEL法检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot技术对bax mRNA及蛋白进行表达分析.结果 AngⅡ处理组内皮细胞的凋亡阳性率显著高于对照组(P<0.05)且具有时间和剂量依赖性,对照组和10-7、10-6、10-5mol/L AngⅡ处理24 h后各组细胞凋亡率分别为(2.2±1.1)%、(6.0±1.2)%、(17.5±2.3)%、(27.4±4.5)%;终浓度10-6mol/L的AngⅡ处理6、24、48 h后细胞凋亡率分别为(6.2±2.3)%、(15.5±3.1)%、(21.6±2.5)%;FB1能显著抑制AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡(P<0.05),AngⅡ处理组bax mRNA及蛋白的表达较对照组显著升高(P<0.05),FB1组bax mRNA和蛋白表达较对照组没有显著变化(P>0.05).结论 AngⅡ通过神经酰胺及bax诱导细胞凋亡,其中bax作为神经酰胺的下游基因起作用.     

肝素寡糖对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响及分子机制研究

以脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs炎症损伤,探讨肝素寡糖对炎症的影响及其分子机制。实验分为空白组(0.5%血清培养基)、模型组(LPS+0.5%血清培养基)及给药组(LPS+0.5%血清培养基+0.01、0.1、1 μmol/L HDO),采用活性氧实验检测细胞内活性氧簇水平,Western blot检测VCAM-1、p38、p-p38及核转录因子NF-κB等关键蛋白的表达水平。结果显示0.01、0.1和1 μmol/L的HDO可抑制100 μg/mL LPS诱导的HUVECs炎症因子VCAM-1表达水平,较弱的影响细胞中NF-κB分布,并下调信号通路中关键蛋白p38和p-p38表达。结果表明,HDO可能通过抑制炎症信号通路中关键蛋白的表达水平来抑制炎症因子的表达,从而起到抗炎作用。     

地塞米松诱导人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：观察地塞米松对人脐带静脉血管内皮细胞( ECV304)增殖的影响。方法：采用细胞凋亡的荧光检测法（Heochst 33342）检测地塞米松对脐静脉血管内皮细胞（ECV304）的形态学改变, MTT 法观察地塞米松对ECV304增殖的抑制作用,流式细胞仪术检测地塞米松引起的ECV304凋亡率改变。结果：较高剂量（100umol/L）地塞米松对脐静脉血管内皮细胞增殖起抑制作用,并诱导其凋亡。结论：地塞米松具有比较明显的抑制血管内皮细胞增殖的作用。地塞米松抗血管生成的机制可能与其抑制血管内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

川芎嗪对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞高通透性的保护作用研究

目的:观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)通透性变化和细胞骨架相关蛋白表达影响.方法:以体外培养的HUVECs为实验对象,将...     

马兜铃酸对人脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响

目的 研究马兜铃酸(AA)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响.方法 通过Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率,western blot法检测凋亡蛋白bcl-2和bax的表达及比色法测定caspase-3的活性.结果 马兜铃酸可引起内皮细胞核出现凋亡形态学改变,且呈浓度依赖方式增加了内皮细胞凋亡率.同时可降低内皮细胞内bcl-2蛋白的表达,增加bax蛋白的表达,使caspase-3活性增加.结论 马兜铃酸可抑制内皮细胞内bcl-2蛋白的表达,促进bax的表达,增加caspase-3的活性,从而使内皮细胞出现凋亡.     

尼古丁对血管内皮细胞自噬的影响

目的 初步探讨尼古丁对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endotheliel cell,HUVEC）自噬的影响。方法 采用蛋白免疫印迹（Western blot）技术分别检测尼古丁不同浓度（0、6×10^-8、6×10^-7、6×10^-6和6×10^-5mol/L）和不同时间（浓度为6×10^-6mol/L时,分别干预0、1.5、3、6和12h）作用后,人脐静脉内皮细胞中自噬标志性蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）蛋白表达水平的变化,以确定尼古丁的最佳刺激浓度和最佳刺激时间。依据尼古丁最佳条件将体外培养的HUVE细胞随机分组：对照组、尼古丁处理组,Western blot法检测LC3Ⅱ、多聚泛素结合蛋白p62/SQSTM1（p62）和溶酶体相关膜蛋白-2（LAMP-2）的蛋白表达,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡率。结果 体外实验显示,LC3Ⅱ蛋白表达呈浓度和时间依赖性,且尼古丁浓度为6×10^-6mol/L、时间为6h时,LC3Ⅱ蛋白表达最多（P<0.01）。与对照组相比,尼古丁处理组LC3Ⅱ、p62蛋白表达显著增加（P<0.05）,LAMP2蛋白表达减少（P<0.05）,细胞凋亡率升高（P<0.01）。结论 尼古丁可以引起自噬体与溶酶体融合障碍,使自噬降解异常,导致内皮细胞自噬功能紊乱,促进细胞凋亡。     

高糖对脂多糖诱导的大鼠肺微血管内皮细胞自噬的影响

目的:探究高糖(HG)环境对脂多糖(LPS)处理的大鼠肺微血管内皮细胞(RPMECs)自噬的影响.方法:LPS联合HG处理RPMECs 24 h后;相应商品化试剂盒检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量.免疫印迹法检测Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC-3...     

TRPC_3参与缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡

目的:探讨瞬时受体电位通道蛋白3(TRPC3)在缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡中的作用。方法:采用HUVECs细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于6孔培养板中,实验组分为常氧对照组(5%CO2+95%空气)和缺氧组(1%O2+5%CO2+94%N2),处理24h后,应用实时荧光定量RT-PCR法及WesternBlot法检测TRPC3mRNA和蛋白水平的表达变化。构建靶向TRPC3基因的siRNA和无关序列质粒表达载体,分别转染至HUVECs,缺氧处理后再用四甲基偶氮唑盐比色法(Methods the tetrazolium,MTT)检测各组细胞存活率,Hoechest33342荧光染色观察细胞凋亡。结果:缺氧处理24h,HUVECs中TRPC3mRNA和蛋白表达明显升高,细胞存活率为67.4%,与常氧对照组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3干扰组细胞存活率为92.7%,与缺氧组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3假干扰组与缺氧组无显著性差异(P>0.05)。荧光显微镜下观察,常氧对照组胞核均匀蓝染;缺氧处理组和缺氧+TRPC3假干扰组胞核明显固缩、凝聚,可见凋亡小体;而缺氧+TRPC3干扰组胞核均匀蓝染。结论:TRPC3参与缺氧诱导HUVECs凋亡。     

二氢杨梅素调控自噬抑制氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究

目的观察二氢杨梅素（DMY）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响,并探讨自噬在其中的作用。方法DMY（0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L）预处理HUVECs 2 h,用100.0 mg/L ox-LDL 继续培养细胞24 h。以辛伐他汀作为阳性对照组。采用噻唑蓝法检测细胞活力,Hoechst33258染色观察细胞核形态,透射电镜观察自噬体,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Beclin-1和p62/SQSTM1的表达,观察自噬抑制剂对DMY作用的影响。结果与对照组比较,ox-LDL组细胞的存活率降低（p <0.05）,细胞核呈集中高强度蓝色荧光,固缩致密浓染或碎块状致密浓染,颜色发白,细胞核较小,形态不规则,自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62的表达下调（p <0.05）。与ox-LDL组比较,0.1、1.0和10.0μmol/L DMY预处理组细胞存活率均升高;细胞核荧光强度降低,核固缩致密浓染和碎块状致密浓染减少,形态较规则;1.0 μmol/L DMY 预处理组的自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62 的表达下调（p <0.05）。自噬抑制剂3-MA 部分抵消DMY 抑制ox-LDL诱导的HUVECs 存活率降低（p <0.05）。结论DMY 能抑制ox-LDL诱导的HUVECs 损伤,其机制与诱导自噬有关。     

球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

目的观察球松素对人脐静脉内皮细胞的保护作用。方法采用灌注消化法分离培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,并对其进行形态学和免疫组织化学染色鉴定。用脂多糖（LPS）诱导建立人脐静脉血管内皮细胞的损伤模型,随后用球松素作用于受损伤细胞,观察其对HUVEC的保护作用。结果倒置显微镜下可见细胞呈梭形,单层铺路石状排列,Factor VIII相关抗原免疫组织化学染色鉴定阳性。100μg/L的LPS对脐静脉内皮细胞生长有明显的抑制作用,可作为人脐静脉内皮损伤模型的造模浓度。球松素能减轻LPS对细胞的损伤（P〈0.05）,并呈剂量依赖关系。结论球松素对LPS所诱导的人脐静脉内皮细胞损伤有保护作用。     

培养人脐静脉血管内皮细胞的研究

以改进的方法培养人脐带静脉血管内皮细胞(HEC),应用Ⅷ因子相关抗原的免疫组化方法进行鉴定,光镜、电镜观察培养细胞的形态变化,并对培养上清液前列环素(PGI_2)及细胞膜ATP酶进行了动态测定。结果表明:原代培养的HEC在一定时间内,其形态与代谢无明显变化。     

白细胞介素6通过抑制自噬促进人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：探讨IL-6对血管内皮细胞自噬和凋亡的影响以及自噬与凋亡的相互作用关系。方法：采用不同浓度IL-6诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖与活性,流式细胞术检测细胞凋亡变化,单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色观察细胞嗜酸性自噬泡情况,透射电镜观察细胞超微结构的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白激活型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase3)以及自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和(sequestosome 1, SQSTM1)/P62表达水平。进一步采用IL-6分别联合自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RP)诱导自噬或3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬,观察自噬对IL-6诱导血管内皮细胞凋亡的影响。结果：1. 与对照组相比,IL-6可以呈浓度依赖性降低血管内皮细胞的活性(P＜0.05),增加血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);2. IL-6浓度依赖性降低血管内皮细胞内LC3-II/LC3-I的表达(P＜0.05)而增加P62的表达(P＜0.05),在IL-6刺激下,MDC 染色观察可见血管内皮细胞内自噬泡逐渐减少(P＜0.05),荧光强度明显减弱,透射电镜下表现为自噬小体明显减少;3. 采用自噬抑制剂3-MA刺激血管内皮细胞,发现3-MA可以进一步抑制IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而增加凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达进一步下降(P＜0.05)和P62的表达进一步增加(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量明显减少(P＜0.05),并且3-MA可以进一步增加IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);4. 进一步采用自噬促进剂RP刺激血管内皮细胞,发现RP可以改善IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而降低凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达升高(P＜0.05)和P62的表达下降(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量的增多(P＜0.05),并且RP可以明显减少IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05)。结论：白介素-6可通过抑制自噬而增加血管内皮细胞凋亡。