基孔肯雅病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法:人工合成基孔肯雅病毒部分有代表性的序列核酸作为阳性对照模板,设计几组实时荧光PCR引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应体系条件.结果:建立的基孔肯雅病毒的实时荧光PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CHIK-FP终浓度500 nM,反向引物CHIK-RP终浓度1000 nM,探针CHIK-Probe终浓度250 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃ 10 min,95℃10 s→62℃30 S 45次循环.结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用

[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法最低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.     

黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法建立

目的建立用于检测黄病毒属的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法。方法从GenBank中检索黄病毒属代表株的全基因序列,通过DNAstar进行序列比对和blast进行保守序列搜索和分析,用Beacon Designer 7.0软件进行引物和TaqMan探针设计,以乙脑毒株MB090509 RNA为模板,优化反应条件并应用于现场蚊虫标本检测。结果确定黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR反应条件为:45℃15 min,95℃10 min,95℃10 s→54℃45 s,40次循环,引物和探针终浓度为200 nmol/L。灵敏度为常规RT-PCR方法 100倍,检出限2.9×10-3噬斑形成单位(PFU)/mL,与甲病毒属、东南亚十二节段RNA病毒属、布尼亚病毒属均无交叉反应。从161份现场蚊虫标本中检测出11份阳性标本,经病毒分离、测序均被证实为乙脑病毒。结论本研究建立的黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有广泛应用价值。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,调整引物、探针浓度,优化最佳反应条件,建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系,进行灵敏度、特异性、稳定性试验,以评价反应体系,并与引物P289/P290常规RT-PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测时限短,仅1h就出结果;最低检出下限为100拷贝/mL,比引物P289/P290常规RT-PCR灵敏度高100倍;与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应;4份核酸含量不同的标本重复检测5次,平均Ct值变异系数范围0.96%～2.27%。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好,可应用于突发公共卫生应急检测,提高快速检测能力。     

马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的建立马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法人工合成马尔堡病毒特异性核酸序列作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR引物、探针并构建反应体系,对反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度。结果建立的马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测方法对马尔堡病毒核酸检测有高度特异性,与1型～4型登革病毒、日本脑炎病毒和基孔肯雅病毒均无交叉反应,检测灵敏度为102拷贝/反应。结论该方法灵敏度高、特异性强,适用于对马尔堡病毒的快速检验。     

辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的建立辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法人工合成辛德比斯病毒特异性核酸序列作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR引物、探针并构建反应体系,对反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度。结果建立的辛德比斯病毒实时荧光RT-PCR检测方法对辛德比斯病毒核酸检测有高度特异性,与1~4型登革病毒、流行性乙型脑炎病毒和基孔肯雅病毒均无交叉反应,检测灵敏度为103拷贝/反应。结论该方法灵敏度高、特异性强,适用于对辛德比斯病毒的快速检验。     

苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR方法的建立

目的建立苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法,为埃博拉病毒分型检测提供技术储备。方法比较15株埃博拉病毒基因序列的保守性和特异性,设计3对引物和探针用于苏丹型埃博拉病毒核酸检测。使用不同浓度的苏丹型埃博拉病毒RNA对照进行检测,确定最佳的引物探针组合、引物探针用量和Mg~(2+)用量,建立苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR方法。对建立的方法进行灵敏度、特异性和精密度分析,并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查。结果经筛选,设计的引物、探针Ebv-S-2F/Ebv-S-2R/Ebv-S-2P对1.6×10~2～1.6×10~5拷贝/ml的阳性对照检出率为100.0%,是最佳的引物探针组合。优化后的实时荧光PCR体系引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L,Mg~(2+)终浓度为2 mmol/L。灵敏度为80拷贝/ml,重复性好,特异性强,对扎伊尔型、科特迪瓦型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照,马尔堡病毒阳性对照、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒等检测结果均为阴性。结论建立的苏丹型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于口岸输入性埃博拉出血热病例的早期检测和分型鉴别。     

科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法的建立

目的建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法,并在广东口岸进行应用。方法分析埃博拉病毒基因组的同源性,设计3组引物和探针用于科特迪瓦型埃博拉病毒核酸检测。对不同浓度的科特迪瓦型埃博拉病毒体外转录RNA进行检测,确定最佳的引物和探针组合、用量,以及Mg~(2+)用量,建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法。对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析,并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查。结果经筛选,引物Ebv-C-3F/Ebv-C-3R和探针Ebv-C-3P对10~2~10~5拷贝/ml的阳性质粒的检出率为100.0%,是最佳的引物和探针组合。优化后的实时荧光PCR体系中引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L,Mg~(2+)终浓度为2 mmol/L。方法的灵敏度为50拷贝/ml,重复性好、特异性强,对扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照样本、马尔堡病毒阳性对照样本和广东口岸非洲发热入境人员血清样本检测均为阴性。结论建立的科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,对于境外输入性埃博拉病毒病病例的早期诊断和分型鉴别具有重要意义。     

甲肝病毒TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对甲肝病毒核酸进行检测。方法根据GenBank发表的HAV全基因组序列资料分析结果,在其保守区段设计HAV特异性引物和探针,优化引物、探针浓度,与最佳退火温度,并考察检测体系的特异性、敏感性与重复性。结果本研究体系的引物和探针浓度为0.8μmol/L和0.6μmol/L,退火温度为52℃时,具有良好的特异性与敏感性,检测灵敏度可达0.1TCID50。同一样品重复检测3次,Ct值的变异系数均小于5%。结论本研究建立的HAV TaqMan RT-PCR方法特异、敏感、快速且有效减少交叉污染的概率,为临床及水产品中的甲肝病毒的早期快速检测提供了一种新方法。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

克里米亚-刚果出血热病毒特征核酸序列克隆载体的构建

目的构建含有克里米亚-刚果出血热病毒特征序列的克隆载体。方法设计RT-PCR引物及反应体系,从克里米亚-刚果出血热病毒RNA中扩增获得目的序列,进行分离纯化和回收,将纯化的扩增片段与pMD18-T载体进行连接,进行酶切鉴定与测序鉴定。结果确定检测克里米亚-刚果出血热病毒一步法RT-PCR的反应条件及体系,引物终浓度为400 nmol/L,反应条件为:50℃30 min,94℃4 min,94℃30s,57℃30 s,72℃30 s,35cycles.成功将CCHF的特征序列片段克隆,pMD18-T载体经DNA测序鉴定正确。结论构建的pMD18-CCHF质粒,可用于克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR实验的阳性对照。     

流行性感冒病毒应急检测中缩减荧光定量逆转录-聚合酶链反应时间的实验研究

目的在相同的敏感度与特异性条件下,进一步缩减流行性感冒(流感)病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的时间,为应急检测服务。方法缩短荧光定量RT-PCR经典检测方法中不同反应阶段的时间参数,并与经典方法进行比较,考察改良方法的检测敏感性与特异性。结果用经典方法与缩短某些时间参数的改良方法检测甲3型流感病毒,结果其特异性与灵敏度差异无显著的统计学意义,并可将检测时间缩短1h左右。结论适当缩短经典荧光定量RT-PCR方法中的逆转录、变性以及延伸时间后,灵敏度和特异性无显著影响,这对于突发疫情的应急检测具有实用价值。     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒(流感)病毒的灵敏度与特异性.方法采用建立的实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离等3种方法,同时对流感监测点送检的60份疑似流感标本检测甲3型流感病毒.结果细胞病毒分离的阳性数为10份,RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR的阳性数分别为12份和15份.实时荧光定量RT-PCR的灵敏度达0.01TCID50且对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征冠状病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右.结论实时荧光定量RT-PCR由于检测在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断.     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.     

双重荧光RT-PCR检测4种致病性亚型埃博拉病毒方法的建立

目的建立可同时检测苏丹、扎伊尔、本迪布焦和科特迪瓦4种致病性亚型埃博拉病毒的双重荧光RT-PCR检测方法。方法根据4种致病性亚型埃博拉病毒的核蛋白NP基因保守序列,针对苏丹型/扎伊尔型病毒以及针对本迪布焦型/科特迪瓦型病毒,相应设计2套引物和探针。以体外转录的4种亚型埃博拉病毒RNA为模板,进行条件的优化以及方法特异性、灵敏度、重复性试验,建立双重荧光RT-PCR检测方法。结果新建立的双重荧光RT-PCR方法检测只对4种埃博拉病毒阳性对照RNA模板有特异性扩增,与肾综合征出血热病毒、登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒均无交叉反应,2套引物和探针的检测灵敏度均可达到最低50拷贝/μL。苏丹型和本迪布焦型埃博拉病毒阳性对照RNA模板的4种稀释度（2×108、2×106、2×104、2×102拷贝/μL）重复检测3次均有较好的重复性。结论建立的方法能同时检测上述4种亚型埃博拉病毒,灵敏度高,特异性强,可用于埃博拉病毒疑似病例的检测。     

肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速检测

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定（TCID50）;可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.