靶向于HER2的siRNA表达载体在人乳腺癌细胞SKBr-3中的表达

目的:探讨针对HER2分子的RNA干涉对乳腺癌细胞生长的影响.方法:人工合成DNA,经退火磷酸化后克隆入pSUPER载体.基因转染后通过观察细胞形态和细胞计数等方法验证发夹状小干涉RNA(siRNA)对细胞生长状态的影响,以激光共聚焦检测基因表达情况.结果:siRNA表达载体转染后可以引起SKBr-3细胞大量死亡,间接免疫荧光检测出HER2蛋白表达降低.结论:针对HER2进行RNA干涉可在体外抑制SKBr-3细胞生长.     

hTERT siRNA表达载体的构建及对转染的HeLa细胞生长抑制作用

目的:通过RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨干涉后对肿瘤细胞生长的抑制作用. 方法:根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA编码序列,设计RNA干涉靶点,构建siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并转染HeLa细胞,通过RT-PCR法观察重组质粒转染肿瘤细胞后端粒酶mRNA、蛋白含量及细胞生长情况. 结果:构建的siRNA表达载体可以使HeLa细胞端粒酶逆转录酶mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度减慢. 结论:成功构建了针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中端粒酶的表达,并引起细胞生长抑制.     

针对HER2/neu的siRNA对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用

目的:构建针对HER2/neu的RNA干涉载体,观察对HER2/neu表达抑制及抑制后对非小细胞肺癌生长的影响. 方法:设计和合成长度为64nt的脱氧寡核苷酸链,退火互补成双链,克隆至pSUPER质粒载体,转化DH5α菌株,提取质粒,转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPC-A-1,RT-PCR检测HER2/neu的mRNA表达,Western blot和间接免疫荧光法检测HER2/neu的蛋白表达,FCM分析细胞周期变化,MTT法观察细胞生长. 结果:肺腺癌细胞系SPC-A-1存在HER2/neu过表达;成功构建了HER2/neu特异性RNA干涉载体pSUPER-siHER2;瞬时转染SPC-A-1细胞,HER2/neu的mRNA及蛋白表达均降低;G1期细胞较亲代增加9.9%;肿瘤细胞增殖速度减慢(P＜0.05). 结论:成功构建了HER2/neu RNA干涉载体,转染后可有效降低肺腺癌细胞系SPC-A-1 HER2/neu的mRNA转录及蛋白水平表达,阻滞转染细胞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为肺癌基因治疗提供一种选择手段.     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其表达

目的 构建针对人caspase-8 基因mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中caspase8的抑制作用.方法 化学合成针对caspase-8发夹状的RNA寡核苷酸,将其退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,RT-PCR测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果 成功地构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-C1和pSUPER-C2,并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase8基因的干涉作用,而且pSUPER-C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER-C2.结论 成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体,转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达.     

RNAi抑制NEK293细胞TGF-β1表达的研究

目的:探讨针对转化生长因子β1(TGF-β1)的小干扰RNA(siRNA)对大鼠肾间质细胞系(NEK293)TGF-β1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用.方法: 利用RNA干扰(RNAi)效应设计针对TGF-β1的不同siRNA,构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系.RT-PCR和WesternBlot分别检测TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化.另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照.结果: siRNA转染效率70%,特异性siRNA对TGF-β1 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用(P>0.05),实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加(P>0.05).结论: 应用RNAi技术可明显抑制TGF-β1的表达,并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡.     

PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响. 方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡. 结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体. 它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率最高,可达93.99%. HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P＜0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率最高,为66.91%. 结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.     

LINE-1ORF-1p对ERα阳性乳腺癌细胞的体外影响研究

目的探讨人反转座子长散在重复序列编码蛋白1(LINE-1 ORF-1p)对ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响及可能机理。方法利用Lipofectin 2000将LINE-1 ORF-1的表达载体及其空载体,siRNA及其空载体转染进入ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1细胞。使用MTT法测定LINE-1 ORF-1p对ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响;利用Luciferase检测LINE-1 ORF-1p对ERα转录活性的影响。结果 MTT法观察结果发现,LINE-1 Flag-ORF-1p能够显著促进ZR75-1细胞的生长(P=0.018)。LINE-1 ORF-1p siRNA表达载体能够抑制ZR75-1细胞的生长(P=0.022),其体外抑制率为E2-:25.51%,P=0.025,E2+:64.29%,P=0.021。LINE-1 Flag-ORF-1p能够升高ERα的转录活性(P=0.008)。LINE-1 ORF-1psiRNA表达载体能够降低ERα的转录活性(P=0.015),结论 LINE-1 ORF-1p能够通过升高ERα的转录活性,促进乳腺肿瘤细胞ZR75-1生长。     

靶向Livin基因siRNA载体的构建和沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察该载体对食管癌细胞Livin基因表达的沉默效应。方法:依据siRNA设计原则,分析Livin mRNA序列,设计并合成2个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pSUPER-neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹法将重组质粒转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR检测转染细胞Livin mRNA的表达。结果:经过酶切鉴定与测序,构建的靶向Livinα和Livinβ基因的siRNA载体,结果正确;RT-PCR检测显示,转染细胞Livin mRNA的表达水平降低。结论:成功构建沉默细胞Livin基因表达的siRNA载体。     

17β-雌二醇促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移及三叶草因子1分泌

目的 研究17β-雌二醇(estradiol,E2)刺激甲状腺乳头状癌K-1细胞增殖、迁移及生长因子类似物人三叶草因子1(trefoil factor family 1,TFF1)分泌及分子机制.方法 ELISA检测E2、ERβ激动剂(propylpyrazoletriol,PPT)、ERβ激动剂(diarylpropionitrile,DPN)对K-1细胞TFF1分泌的影响,Western blot检测细胞中雌激素受体ERα、ERβ的表达量;设计合成ERα siRNA、ERβ siRNA后,转染K-1细胞,采用ELISA观察其对E2诱导的TFF1分泌的影响.染色体免疫共沉淀检测ERα、ERβ与TFF1基因启动子的相互作用;MTT检测E2对K-1细胞增殖的影响;Transwell检测E2对K-1细胞迁移的作用.结果 E2处理后K-1细胞上清TFF1含量逐渐升高,24 h达到峰值,随后降低;PPT处理K-1细胞后TFF1含量增多,而DPN处理降低TFF1含量;转染ERα siRNA后细胞TFF1分泌量减少;而转染ERβsiRNA后分泌量升高.Western blot检测结果显示,K-1细胞中雌激素受体ERα表达高于ERβ.染色体免疫共沉淀结果显示,ERα能与TFF1基因启动子区域结合;MTT结果显示,E2处理促进K-1细胞增殖;Transwell检测结果显示,E2处理增强K-1细胞迁移.结论 E2可以通过ERα促进K-1细胞中TFF1的表达及分泌,促进细胞增殖和迁移.     

调控Livin基因表达对食管癌EC9706细胞生物学行为的影响

目的:探讨调控Livin基因表达对食管癌EC9706细胞生长速度、细胞凋亡以及放射线敏感性的影响.方法:取EC9706细胞,分7组,siRNA组、Livinα组、Livinβ组分别用脂质体包裹法转染沉默Livin表达的siRNA载体pSUPER-neo-Sli1、Livinα表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα及Livinβ表达载体pIRES2-AcGFP-Livinβ;Livinα/β组同时转染pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,空siRNA载体组转染pSUPER-neo,空表达载体组转染pIRES2-AcGFP,空白对照组不转染.取各组细胞,荧光定量RT-PCR法检测Livin mRNA表达情况,MTT法测定细胞生长曲线,TUNEL法检测细胞凋亡,同时检测Caspase-3 活性及放射线敏感性.结果:与空白对照组比较,空表达载体组、空siRNA载体组细胞倍增时间、凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性差异均无统计学意义(P＞0.05).与空白对照组比较,Livinα组、Livinβ组和Livinα/β组细胞倍增时间、凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性均降低(P＜0.05);siRNA组细胞凋亡指数、Caspase-3活性和放射线敏感性增加(P＜0.05),细胞倍增时间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:调控EC9706细胞Livin基因的表达,可有效改变细胞的生物学行为;Livin基因可能成为肿瘤治疗的新靶点.     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

容量调控氯通道基因siRNA表达载体的构建及其沉寂效应检测

目的:构建针对容量调控氯通道基因(CLC3)的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对CLC3基因的干扰作用. 方法:设计CLC3靶向的发夹状siRNA,据此设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER载体,转化扩增后进行序列测定. 用脂质体转染法转染胃癌细胞SGC7901,通过RT-PCR、间接免疫荧光检测CLC3基因表达水平的变化. 结果:把针对CLC3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确,稳定转染人胃癌细胞SGC7901后, RT-PCR、间接免疫荧光检测表明,CLC3基因的表达水平明显降低. 结论:构建了针对CLC3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制CLC3基因表达.     

反义寡核苷酸对子宫内膜癌细胞雌激素受体亚型α特异性调控的研究

目的:初步建立子宫内膜癌雌激素受体亚型α(estrogen receptor α, ERα)弱表达细胞模型,探讨ERα在子宫内膜癌发病机制中的作用,研究17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)及三苯氧胺(tamoxifen, TAM)在子宫内膜癌发病过程中与ERα的关系。方法:设计针对ERα的反义寡核苷酸 (antisense oligodexyribonucleotides, AS-ODN),转染入子宫内膜癌HEC-1B细胞,Western blot 测定转染后细胞ERα的表达;检测转染反义寡核苷酸后E2和TAM对子宫内膜癌细胞生长影响的变化。结果: (1)针对ERα翻译启动区设计的反义寡核苷酸可以选择性下调ERα的表达。 (2) E2和TAM可以促进子宫内膜癌细胞系HEC-1B的生长。转染ERα-AS-ODN后可抑制E2对子宫内膜癌细胞HEC-1B的促生长作用,这种抑制作用以转染后的24,48及72 h尤为明显。转染ERα-AS-ODN可抑制TAM对子宫内膜癌细胞HEC-1B的促生长作用,这种抑制作用在转染后的48 h最为明显。结论: 初步建立了ERα弱表达的子宫内膜癌细胞模型。反义核酸技术可以作为一种有效的特异性下调子宫内膜癌细胞中ERα的实验手段。在HEC-1B细胞中,ERα抑制E2和TAM的促进子宫内膜癌细胞生长的作用。     

胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的研究胃癌相关基因GCRG213 siRNA转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法1）设计两对针对GCRG213可转录为小干扰RNA（siRNA）的DNA片段,退火后插入小干扰RNA表达载体IMG-800。2）测序正确的重组子IMG-800—1,IMG-800-2和空载体转染MKN45细胞,采用RT—PCR及Western法比较GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。3）绘制细胞生长曲线,分析细胞的增殖状态,检测凋亡细胞。结果1）干扰片段正确插入小干扰RNA表达载体IMG-800。2）重组子和空载体转染MKN45细胞。3）转染siRNA的MKN45细胞中其mRNA的表达下调44．9％和49．5％;其蛋白的表达下调55．3％和64．2％。4）转染siRNA的MKN45细胞生长增殖速度减慢,处于G0-G1期的细胞增加,G2／M期和／或S期的细胞比例减少,细胞凋亡率增加。结论siRNA转染可抑制肿瘤细胞的生长和增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α治疗骨肉瘤的实验研究

目的　观察靶向缺氧诱导因子 (HIF)- 1α的短发夹状小干扰RNA基因转染对骨肉瘤生长的影响。方法　针对HIF- 1α构建短发夹状siRNA真核表达载体 (pSilencer) HIF并转染骨肉瘤细胞系(SaOS) 2。骨肉瘤细胞置于缺氧诱导培养基中培养。逆转录 聚合酶链反应 (RT -PCR)和免疫印迹沉淀观察HIF -1α的基因沉默效果。四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色分析检测细胞体外增殖活力,透射电镜,原位末端标记TUNEL法,AnnexinV/PI双标记法检测细胞的凋亡。同时,通过裸鼠移植瘤模型观察HIF- 1α基因沉默后对骨肉瘤体内治疗效果。结果　测序证实成功构建HIF- 1α的短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer HIF,转染骨肉瘤细胞后,HIF -1α基因表达显著抑制 ( 90% )。与对照组比较,pSilencer HIF转染组骨肉瘤细胞缺氧状态下的增殖活性显著降低。缺氧培养 72h后,透射电镜、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征,AnnexinV/PI双标检测转染组细胞凋亡率为 18. 71% ±0. 98%,明显高于pSilencer neo空载体转染组和未转染组 (P< 0 .01 )。裸鼠移植瘤实验显示pSilencer HIF转染组肿瘤生长减慢,成瘤率下降,肿瘤组织中可见大量坏死组织。结论　靶向HIF- 1α基因的短发夹状siRNA可以有效阻断骨肉瘤缺氧耐受转导通路,抑制骨肉瘤细胞的生长。     

siRNA对体外培养红系细胞α-珠蛋白基因表达的影响

目的 研究针对α-珠蛋白基因的小分子干扰RNA(siRNA)对体外培养红系细胞α-珠蛋白肽链mRNA表达的影响.方法 将针对α-珠蛋白肽链设计、化学方法合成的siRNA通过脂质体转染体外培养正常人的红系细胞,在转染后24、48、72 h,用流式细胞术检测转染效率,RT-PCR检测α链mRNA表达水平.结果 脂质体转染FCM标记的siRNA进入红系细胞后,24、48、72 h的转染效率分别为61.2%、44.3%、33.7%.siRNA作用于体外培养的红系细胞,经RT-PCR检测,转染后α-珠蛋白基因mRNA相对表达量下降,浓度越高,相对表达量越低.随着作用浓度增加,红系细胞台盼兰拒染率越低;且作用时间越长,台盼兰拒染率也越低.结论 脂质体转染siRNA能特异性地抑制体外培养的红系细胞中α-珠蛋白基因表达,可能会成为β-珠蛋白生成障碍性贫血基因治疗的一个新靶点.     

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性（P﹤0.05）.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.     

AMACR siRNA表达载体对前列腺癌PC 3细胞生物学特性的影响

目的 观察转染α-甲酰辅酶A消旋酶(AMACR)干涉载体后对前列腺癌PC-3细胞系生长状态的影响.方法 用脂质体将pSilencer/AMACR1转染前列腺癌PC-3细胞,通过细胞计数、MTT、软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V-FITC检测细胞凋亡.结果 siRNA干涉载体瞬时转染PC-3前列腺癌细胞系后,36 h细胞增殖率开始明显下降,软琼脂集落形成减少,流式细胞分析示细胞周期阻滞在G0/G1期(88.6%),Annexin V-FITC法示早期凋亡细胞率68.3%.结论 利用RNA干涉技术抑制了前列腺癌PC-3细胞系的增生,可能会成为一种有效的前列腺癌基因治疗手段.     

糖皮质激素受体α基因RNA干扰的生物学效应研究

目的采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,通过构建人糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor α, GRα)基因的特异性siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对GRα基因的沉默作用及生物学效应. 方法采用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性GRα干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体(pPUR/U6),构建GRα siRNA的表达载体,转染体外ECV-304细胞,48 h后观测胞内GRα蛋白水平(Western blot)及对LPS刺激后细胞因子产生的影响作用.结果①成功构建发卡样GRα siRNA真核表达载体(pPUR/U6- GRα siRNA);②pPUR/U6- GRα siRNA转染(脂质体法)ECV-304细胞,48 h后明显下调胞内GRα蛋白水平;③转染pPUR/U6-GRα siRNA的细胞,在LPS刺激后,其TNF-α、IL-1β的表达释放显著高于空载体对照组.结论该RNA干扰真核表达载体能明显干扰GRα蛋白的表达、释放,结果促进了LPS刺激后炎性细胞因子的表达释放.进一步说明严重创伤所引起的糖皮质激素受体下调是机体应激紊乱的重要原因.