酿酒酵母HOR2基因缺失突变株的构建

目的:构建酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株并研究其对甘油和乙醇产量的影响。方法:以PCR为基础,通过同源重组的方式使目的基因缺失。结果:通过设计含有与HOR2(GPP2)基因两侧序列同源的长引物,以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母HOR2基因敲除组件,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS2,获得为loxP-kan-loxP序列组件所替换而产生kanr的阳性克隆子。然后再将质粒PSH65转入阳性克隆子诱导表达Cre酶切除筛选标记,在原ORF基因处保留一个loxP位点,丢失质粒后获得HOR2单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除。发酵实验表明,突变株甘油产量降低3.34%,乙醇产量提高1.96%。结论:成功获得了酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株,并命名为YS2-HOR2。     

酿酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的构建

构建一株酿酒酵母SNF4基因缺失菌株并研究其对乙醇产量的影响。扩增带有SNF4基因上下游同源序列和Kanr筛选标记的SNF4基因敲除组件,转化到酿酒酵母YS2获得阳性克隆子,然后将质粒pSH65转到阳性克隆子中,半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr筛选标记,获得SNF4等位基因完全缺失菌株YS2-△SNF4。发酵实验结果表明,缺失菌株YS2-△SNF4乙醇产量较出发菌株提高了7.57％。利用Cre-LoxP系统,成功构建了SNF4等位基因完全缺失菌株并提高乙醇产生量。     

单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlB/actA双缺失突变株的构建

单核细胞增生李斯特菌inlB和actA毒力基因的编码产物InlB和ActA是与其致病性相关的重要毒力因子,与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而内化素InlB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要作用。本研究中利用同源重组技术在inlB缺失菌株基础上成功构建了毒力基因inlB和actA双缺失的突变株,获得减毒突变株,为构建预防人类和动物疾病的疫苗载体奠定了基础。     

敲除sfa1基因提高酿酒酵母乙醇合成能力的研究

sfa1基因编码的酶具有乙醇脱氢酶和甲醛脱氢酶双功能活性,通过设计含有与sfa1基因两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6和pUG66为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的酿酒酵母sfa1基因敲除组件,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS1并将质粒pSH47转入阳性克隆子,诱导表达Cre酶切除筛选标记,在原ORF基因处保留一个loxP位点,丢失质粒后获得sfa1基因缺陷型酵母突变株YS1-sfa1。摇瓶发酵实验表明,突变株YS1-sfa1的乙醇分解代谢活性降低,乙醇产量提高8.0%。     

猪链球菌2型srtF基因敲除突变株的构建及其毒力

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33 srtF同源突变体。组合PCR、交叉酶切、RT-PCR结果均显示srtF突变体构建成功。突变株与强毒株的菌落形态、生长速率以及对小鼠的致病力均无显著性差异。小鼠竞争实验结果提示,突变株在心脏的定殖及感染能力显著减弱。成功构建的srtF突变株为进一步研究srtF的生物学功能奠定了基础。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变株的构建

目的:构建弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变体,以研究yciD基因的功能。方法:根据弗氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用Red重组系统对yciD基因进行缺失,并经PCR和SDS-PAGE证实;对野生株和突变株的生长状态及生化反应进行比较研究。结果:构建了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株2457TΔyciD,该突变株外膜蛋白样品中缺失了一条相对分子质量与从yciD基因推导的蛋白相当(约22000)的蛋白带。该突变株比野生株生长快,利用葡萄糖和甘露醇的能力也比野生株大为增强。结论:获得了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株。     

采用基因敲除和反义技术抑制酿酒酵母ERG7基因表达

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)固有的甲羟戊酸(MVA)/麦角甾醇代谢途径生成的中间体2,3-氧化鲨烯是三萜类化合物的合成前体,以酿酒酵母为底盘细胞通过合成生物学技术组建这些化合物的代谢途径时,需要下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢流。在酿酒酵母中由羊毛甾醇合酶(ERG7)催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点。采用基因敲除和反义RNA 2种技术对ERG7基因的表达进行下调。设计含有与ERG7基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒PUG66为模板进行PCR扩增,构建带有loxP-Marker-loxP的ERG7基因敲除组件,采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG方法转化双倍体酿酒酵母INVSc1,通过同源重组的方式获得酿酒酵母ERG7基因单倍体缺失突变株,并对其进行了分子生物学确证。大量培养野生型和突变型菌株,菌体冷干后在碱醇溶液中90℃回流1h,正己烷萃取后旋蒸干溶剂,甲醇溶解残留物麦角甾醇。通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与野生型菌株相比,突变型菌株的麦角甾醇含量明显降低。     

2型猪链球菌SSU0448基因敲除突变株的构建及其毒力分析

【目的】 通过构建2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33的SSU0448基因缺失突变株Δ0448和互补株CΔ0448,探索SSU0448基因缺失对细菌基本生物学特性和细菌毒力的影响。【方法】用同源重组基因敲除方法构建筛选强毒株05ZYH33中N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢途径相关转录调节因子SSU0448基因的缺失突变株,比较分析突变株Δ0448与野生株05ZYH33、互补株CΔ0448的基本生物学特性,小鼠毒力实验分析SSU0448基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】PCR检测分析显示,SSU0448基因在转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明基因敲除突变株构建成功;同时构建了基因功能互补株CΔ0448。生物学特性实验表明突变株Δ0448在成链能力上较野生株明显减弱,对数生长期稍短,快速到达平台期;而菌落形态、革兰氏染色和溶血活性方面无明显差异;小鼠毒力实验发现,突变株毒力并无显著改变。【结论】SSU0448基因的敲除能够改变2型猪链球菌的成链能力;不影响其侵袭致病能力,可能延缓2型猪链球菌的发病过程,此研究为2型猪链球菌致病感染奠定了基础。     

伤寒沙门菌bcfD基因敲除突变株的构建

目的:构建伤寒沙门菌Ty2菌株菌毛亚单位bcfD基因敲除突变株.方法:利用交错PCR得到bcfD基因缺失且含其两侧翼序列的片段,将该片段与pMD 18-T连接,亚克隆到pYG4,电转入大肠埃希菌S17-1/λpir菌株,阳性菌株与受体菌伤寒沙门氏菌Ty2进行固相杂交后筛选.结果:成功获得敲除bcfD基因序列954bp的敲除突变株.结论:交错PCR有利于细菌基因精确敲除突变株的构建,bcfD基因敲除株的构建将为进一步研究该基因在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.     

酿酒酵母ADH3基因的敲除

设计含有与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乙醇脱氢酶Ⅲ的ADH3基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除组件。转化酿酒酵母YS3(Saccharomyces cerevisiae),并将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因,在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH65质粒,在原ORF处留下一个loxP位点,获得ADH3单倍体缺陷型菌株。利用同样的方法再次敲除双倍体的另一个等位基因。最终获得ADH3双倍体基因缺陷型突变株YS3-ADH3。     

酿酒酵母工业菌株中XI木糖代谢途径的建立

根据代谢工程原理,采取多拷贝整合策略,利用整合载体pYMIKP,将来自嗜热细菌Thermusthermophilus的木糖异构酶(XI)基因xylA和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)自身的木酮糖激酶(XK)基因XKS1,插入酿酒酵母工业菌株NAN-27的染色体中,得到工程菌株NAN-114。酶活测定结果显示,NAN-114中XI和XK的活性均高于出发菌株NAN-27,表明外源蛋白在酿酒酵母工业菌株中得到活性表达。对木糖、葡萄糖共发酵摇瓶实验结果表明,工程菌NAN-114消耗木糖4.6g/L,产生乙醇6.9g/L,较出发菌株分别提高了43.8%和9.5%。首次在酿酒酵母工业菌株中建立了XI路径的木糖代谢途径。     

酿酒酵母中对抗真菌药物克霉唑敏感的突变菌株的筛选

克霉唑是一种临床上用于抗真菌感染的抗真菌药物,同时也具有治疗其他疾病如疟疾、脚气病、足癣和癌症的前景。通过96孔板液体培养及倍比稀释的方法,对模式真菌酿酒酵母双倍体单基因缺失株文库中的4 532个非必需基因缺失株进行初步筛选及表型验证,对筛选出的敏感菌株测定了加克霉唑和不加克霉唑细胞内的ROS水平变化。筛选得到了127个克霉唑敏感的单基因缺失株,127个敏感菌株缺失的基因,其功能分别参与细胞的代谢过程、细胞周期和DNA加工过程、转录过程、蛋白命运(折叠,修饰,靶向运输)、细胞运输、细胞通讯/信号转导机制、细胞命运、细胞组分的发生和起源、不同细胞类型的分化、细胞营救、防御及毒力、细胞与环境交流和调节代谢及蛋白功能的过程,也有33个基因的功能未知。ROS测定结果显示,加入克霉唑之后,和野生型相比,25个菌株细胞内ROS显著升高,13个菌株细胞内ROS水平反而显著降低。克霉唑的抗真菌作用可能是多个细胞过程的集合,研究结果为克霉唑的改进利用及新的抗真菌药物研发提供理论基础。     

1种用于检测抑制基因功能的酵母株系的建立

酵母被广泛用于分子生物学中基因功能的检测。为扩大酵母株系UCC419在抑制基因活性检测方面的应用,本研究通过向UCC419株系中导入用特殊引物扩增出的包含标记基因TRP1的PCR片段,利用同源重组将UCC419中的筛选标记基因LEU2敲除,并同时插入TRP1,新建立的株系命名为UCC419m（m：modi-fied）。UCC419m为TRP1筛选、leu2突变型菌株,其它基因型均同UCC419。给UCC419m中转入携带LEU2的质粒pDEST32检测是否能恢复其表现型,同时转入不携带LEU2的质粒pDEST22作为阴性对照,将转化子在不含LEU2与URA3的培养基中培养,结果显示,携带LEU2质粒pDEST32的转化子能够在LEU2与URA3缺陷型培养基上正常生长,而不携带LEU2质粒pDEST22的转化子不能生长。本研究结果表明,成功建立了一种适用于基于Invitrogen载体的抑制基因活性检测或从文库中筛选抑制基因的酵母菌株。     

Proline accumulation by mutation or disruption of the proline oxidase gene improves resistance to freezing and desiccation stresses in Saccharomyces cerevisiae

We examined the role of intracellular proline under freezing and desiccation stress conditions in Saccharomyces cerevisiae. When cultured in liquid minimal medium, the proline-nonutilizing mutant containing the put1 mutation (proline oxidase-deficient) produced more intracellular proline, and increased the cell survival rate as compared to the wild-type strain after freezing and desiccation. We also constructed two PUT1 gene disruptants. PUT1-disrupted mutants in minimal medium supplemented with external proline at 0.1% accumulated higher proline levels than those of the control strains (17-22-fold). These disruptants also had a 2-5-fold increase in cell viability compared to the control strains after freezing and desiccation stresses. These results indicate that proline has a stress-protective function in yeast.     

Characterization of gamma-glutamylamidase-glutaminase activity in Saccharomyces cerevisiae

In a foregoing paper we have shown the presence in the yeast Saccharomyces cerevisiae of an enzyme catalyzing the hydrolysis of L-gamma-glutamyl-p-nitroanilide, but apparently distinct from gamma-glutamyltranspeptidase. The cellular level of this enzyme was not regulated by the nature of the nitrogen source supplied to the yeast cell. Purification was attempted, using ion exchange chromatography on DEAE Sephadex A 50, salt precipitations and successive chromatographies on DEAE Sephadex 6B and Sephadex G 100. The apparent molecular weight of the purified enzyme was 14,800 as determined by gel filtration. As shown by kinetic studies and thin layer chromatography, the enzyme preparation exhibited only hydrolytic activity against gamma-glutamylarylamide and L-glutamine with an optimal pH of about seven. Various gamma-glutamylaminoacids, amides, dipeptides and glutathione were inactive as substrates and no transferase activity was detected. The yeast gamma-glutamylarylamidase was activated by SH protective agents, dithiothreitol and reduced glutathione. Oxidized glutathione, ophtalmic acid and various gamma-glutamylaminoacids inhibited competitively the enzyme. The activity was also inhibited by L-gamma-glutamyl-o-(carboxy)phenylhydrazide and the couple serine-borate, both transition-state analogs of gamma-glutamyltranspeptidase. Diazooxonorleucine, reactive analog of glutamine, inactivated the enzyme. The physiological role of yeast gamma-glutamylarylamidase-glutaminase is still undefined but is most probably unrelated to the bulk assimilation of glutamine by yeast cells.     

产金属硫蛋白酿酒酵母诱变菌株的生物学功能研究

以酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)单倍体菌株SY1为出发菌株 ,通过紫外线和亚硝基胍复合诱变 ,获得 1株Cu2 高抗性突变株 ,并对其生物学功能进行了研究。结果表明 ,其拮抗紫外线 ,拮抗电离辐射 ,清除·OH自由基能力 ,Cu2 解毒能力均比出发菌株有所提高 ,经 5 0世代培养后 ,其遗传稳定性保持在 96 %以上。     

Purification and Characterization of an Endo-Polygalacturonase from a Mutant of Saccharomyces cerevisiae

An extracellular endo-polygalacturonase (PGase) produced by a mutant of Saccharomyces cerevisiae was isolated. The enzyme was regarded, immunologically, as a PGase belonging to the Kluyveromyces marxianus group. The enzyme had properties similar to the PGase from K. marxianus in heat and pH stability, and N-terminal amino acid sequence. However, the enzyme showed different properties in optimum pH and temperature, molecular weight, and reactivity in antiserum against PGase from K. marxianus, indicating that the enzyme has a different molecular structure from the PGase from K. marxianus.     

苹果酸降解相关基因在酿酒酵母中的表达

微生物降酸是现代葡萄酒酿造重要工艺。将裂殖酵母苹果酸通透酶基因(mae1)和苹果酸酶基因(mae2)克隆到酿酒酵母中,构建了苹果酸酒精酵母;将mae1基因和乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因(mleS)克隆到酿酒酵母中,构建了苹果酸乳酸酵母。构建的酵母重组子能够有效地分解发酵基质中的苹果酸。     

酿酒酵母减数分裂的事件和特异性基因

减数分裂是生物体重要的有性生殖方式,它提供来自母本和父本的基因信息,产生具有生物多样性的子代,使其能够适应环境的变化而不断进化。本文简述了现已阐明的酿酒酵母减数分裂的重要事件如同源染色体配对、联会、基因重组、染色体分裂和特异性基因。在同源染色体配对的过程中现已发现了2条途径,一条由Rad51独立完成,另一条有Dmc1、Hop2、Rad51和Mnd1参与,同时Rad51也可能参与。Red1、Hop1和Zip1是联会复合体的组成成分,而联会也要求其他减数分裂的特异性基因如Hop2的参与。基因重组是减数分裂中最重要的事件,它为子代提供了新的遗传信息,是生物多样性的基础之一。Spo11、Rad52组、Dmc1、Mnd1、Msh4、Msh5、Mek1、Red1和Hop1参与了基因重组。Spo11是发现和研究得最早的启动基因重组的基因之一;Rec8、Spo13和Sgo1参与了染色体分裂的过程。     

酿酒酵母TRK1和TRK2钾吸收缺陷型菌株的构建

为更好的进行钾素营养有关基因表达调控和功能性研究, 我们采用同源重组法通过重叠引物扩增分别将URA3和HIS3基因替代酿酒酵母的TRK1和TRK2基因, 并以酿酒酵母的尿嘧啶合成酶URA3基因和组氨酸合成酶HIS3为标记基因, 在不含尿嘧啶和组氨酸的基本培养基筛选转化子获得了钾离子转运蛋白TRK1和TRK2基因缺失的酿酒酵母钾素营养缺陷型菌株, 该菌株在低K+培养基中导入拟南芥K+转运体基因AtKuP1可恢复正常生长。