黑曲霉发酵直接生产葡萄糖酸—δ—内酯的研究

本试验以黑曲霉505菌株为出发菌株,经γ-射线和硫酸二乙酯(DES)处理后,选出一株产萄葡糖氧化酶多的黑曲霉CUD69菌株,其葡萄糖氧化酶(GOD)活力较出发菌株高3.7倍.另外从提高葡萄糖氧化酶活的观点来看,试验结果表明,DES的诱变效果较γ-射线的好.对菌体生长和其产生葡萄糖氧化酶条件的试验结果表明,碳源种类、氮源种类及其配比,培养液中接入的孢子量、通气量等因素对菌体生长和产GOD影响很大.选出的最适培养条件为:10%蔗糖,0.1%蛋白胨,0.01%MgSO_4·7H_2O,0.04%(NH_4)_2 HPO_4;在每个500ml三角瓶中装100ml培养液时,接种孢子量以200～300万个为宜,摇瓶培养32～34小时,温度30℃.最后在用上述条件下培养的黑曲霉菌丝作了发酵葡萄糖直接生产葡萄糖酸—δ—内酯(GDL)的试验,证明这种方法是可行的,所得产品的外观与性质均与美进口的GDL一致,产品收率为初糖重量的45.1%.     

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联体系葡萄糖分析

酶催化反应具有高效、快速、高选择性,在定量分析领域应用广泛.本文采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联体系,用动力学方法对样品中葡萄糖含量进行分光光度测定,得到了较为满意的结果.     

葡萄糖氧化酶修饰电极响应电流的研究

在一定电解电位和溶液pH范围内,葡萄糖氧化酶修饰电极响应电流随葡萄糖浓度的增加而增大,呈现良好的线性关系.葡萄糖氧化酶修饰电极响应电流随电解电位的增加而增加,也随着溶液pH 的增加而增加.     

黑曲霉bgl基因在毕赤酵母中的表达研究

为构建具有分泌黑曲霉β-葡萄糖苷酶活力的酵母工程菌,探讨β-葡萄糖苷酶基因(bgl基因)在酵母菌中的表达情况.克隆了黑曲霉bgl基因的cDNA片段,利用质粒pPICZαA构建了该基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导培养,检测结果表明黑曲霉bgl基因已成功转入酵母菌中并可正常表达,重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶水解活性,在诱导培养72 h后,发酵液的酶活力可达到0.78 U/mL.     

基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器的研究进展

综述了对葡萄糖具有良好的催化效应且被广泛用于葡萄糖传感器研发当中的葡萄糖氧化酶(GOx)在葡萄糖传感器酶电极中的固定化方法,并分析其对葡萄糖传感器性能的影响;根据连续监测形式将葡萄糖传感器划分成微创式、植入式和无创式,归纳总结了采用不同监测形式的葡萄糖传感器的最新研究进展;最后,对基于GOx的葡萄糖传感器在柔性可穿戴领...     

水凝胶-固定化酶复合物的制备和性能研究

采用原位复合的方法,将固定有葡萄糖氧化酶(GOD)的多孔SiO_2荧光纳米复合粒子复合在具有温度响应的智能水凝胶聚-N-异丙基丙烯酰胺中,制备了水凝胶-固定化酶复合物。利用场发射扫描电镜、红外光谱和DSC差热分析仪等对其进行表征。研究了pH、温度和给酶量对复合物催化性能的影响,获得了复合物的最佳制备条件。研究了在不同温度下复合物对葡萄糖氧化的酶催化"开-关效应"。为研制检测葡萄糖和胆固醇的多参数光纤生物传感器打下了基础。     

电聚高分子膜固定酶制备双酶生物传感器

以N,N-二甲基苯胺作聚合单体,用电化学聚合方法在玻碳电极上同时固定辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶或D-氨基酸氧化酶制备了双酶生物传感器.双酶传感器对葡萄糖或D-氨基酸的响应是通过测定在-0.05V电位下过氧化物酶催化还原氧化酶与底物作用的产物H2O2的还原电流而实现的.葡萄糖传感器和D-氨基酸传感器的线性响应范围分别为5×10-6～2×10-3mol/L和1×10-4～5×10-3mol/L.     

基于新型拼接光子晶体光纤的SPR葡萄糖浓度传感器

本文提出了一种基于表面等离子体共振(SPR)技术的光纤传感器并应用于葡萄糖浓度检测。采用光纤熔接机拼接多模光纤-光子晶体光纤-光子晶体光纤-多模光纤(MPPM)的结构,然后利用磁控溅射在其表面沉积金膜。对传感区的金膜进行巯基乙胺修饰,采用戊二醛固定葡萄糖氧化酶(GOD),使传感器具备了葡萄糖特异性识别功能,并实现了低浓度葡萄糖传感,在0-0.8 mg/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系,并且获得了29.61 nm/(mg/mL)葡萄糖灵敏度,拟合系数达到了~0.954。得益于其易制备、良好的生物相容性以及优异的传感性能,该光纤SPR传感器有望成为生物医学领域中具有发展潜力的传感器之一。     

黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了使黑曲霉脂肪酶基因在毕赤酵母中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从黑曲霉基因组DNA中扩增出脂肪酶基因Lip A,测序结果表明Lip A基因编码区全长894 bp,编码297个氨基酸,与其他黑曲霉脂肪酶基因列序相似性高达99%。将Lip A基因连接到质粒p PIC9K上,构建了p PIC9K-LipA重组载体。将该重组载体转化到毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导,该酶基因在酵母细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株GS115/p PIC9K-LipA经100 L发酵罐发酵144 h,菌体湿重高达100. 5 g/L,发酵液中酶活性达1 950 U/m L。     

新型光纤葡萄糖复合敏感膜的研究

以四乙氧基硅烷(TEOS)为原料,采用溶胶-凝胶法将荧光指示剂(Ru(bpy)3Cl2)和葡萄糖氧化酶(GOD)分散于溶胶中干燥成膜.以葡萄糖溶液作为检测对象,采用锁相放大技术对复合敏感膜进行检测,研究了敏感膜的敏感特性和影响因素.实验结果表明:葡萄糖溶液浓度与复合敏感膜的滞后相移有较好的线性关系,检测线性范围是100-700 mg/dL;响应时间为30 s左右;检测的最佳pH值在7.0附近;重复性实验结果表明复合敏感膜相对偏差为±6.67%,复合敏感膜可以在12周内保持良好活力.     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确。电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15ku一致,其表达量占分泌总蛋白的32%。体外抑菌实验证实重组人溶菌酶蛋白对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌均有明显的抑菌作用,表明在毕赤酵母中成功表达了重组人溶菌酶。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性检测

将PCR扩增的人溶菌酶编码基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,双酶切和测序鉴定表明,重组载体构建正确.电转化毕赤酵母GS115菌株,通过G418筛选获得高拷贝重组菌株后,用甲醇诱导表达;通过SDS-PAGE检测证明上清中有目的蛋白,表达产物与预期大小的人溶菌酶蛋白分子质量15 ku一致,其表达量占分泌总蛋白...     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵

高密度发酵是提高发酵产品、产量的一个非常有效的手段。对一株巴斯德毕赤酵母的植酸酶工程菌Gs115 /phyAⅡ ,采用酵母高密度发酵方法 ,葡萄糖的补加采用逐渐增加的方式 ,控制溶氧和还原糖浓度 ,获得细胞密度为 80g/L。甲醇诱导后 ,最高植酸酶活力达到 4 .1× 10 4U/mL。     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

胰岛素原基因的高效分泌表达系统——甲醇酵母Pichia pastoris

为了提高重组人胰岛素的表达效率，使用了近年发展起来的真核表达系统-甲醇酵母Pichia
pastoris.　Pichia pastoris以甲醇为其惟一碳源，而乙醇氧化酶基因的启动子是强启动子，可用来调控
异源蛋白的表达.该系统具有操作技术简单，可进行高水平的胞内或胞外表达，及对表达产物进行翻译后
修饰与加工等显著优点.将含有小C肽或不含有C肽的人胰岛素原类似物基因整合到酵母基因组上来发酵生
产人胰岛素原，在表达量上，每升发酵液中可以得到胰岛素原250～300 mg，分泌水平约占总蛋白量的20%
，重组人胰岛素具有与猪胰岛素相同的受体结合能力和生物活性.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sac Ⅰ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS 115/pPICZαA - LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPlCZαA-LAI经1％甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的亚克隆及表达

将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。结果显示,重组酵母菌在甲醇体积分数为0.5%,72 h培养后,所提取的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其分子质量为52 ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。     

燕麦β-葡聚糖水解酶发酵条件的优化及其应用

通过单因素实验和均匀实验确定由黑曲霉3112s产β-葡聚糖水解酶的最佳条件,并初步应用该水解酶水解燕麦β-葡聚糖。结果表明,最佳产酶培养基组成为麸皮15g、豆粕5g、葡萄糖1.2g、硫酸铵0.16g、水20mL。最佳发酵条件为pH 6.5、29℃、发酵6d,此时水解酶的酶活力达到183.27U/mL。用最优条件制备的β-葡聚糖水解酶对燕麦β-葡聚糖进行水解,水解之后燕麦β-葡聚糖的相对分子质量由1.69×106降为6.71×104。