大鼠脑组织NT-3融合蛋白的表达、纯化及抗体制备

目的克隆大鼠脑组织神经营养素3(NT-3)基因,原核诱导表达并纯化,制备高效价抗体,为研究其对周围神经损伤修复的影响提供实验基础。方法用RT-PCR法扩增目的基因,依次克隆入pMD-18T载体及亚克隆入pRSET-A原核表达载体。导入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定后用镍柱纯化。免疫家兔制备特异性抗体。结果RT-PCR得到777 bp的片断,酶切鉴定及测序证实与GeneBank中大鼠NT-3序列一致,成功构建了原核表达载体pRSET-A-NT-3。导入BL21诱导得到一条约34 ku的新蛋白带。免疫家兔获得1∶64000的高效价特异性抗大鼠NT-3血清。     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆小鼠TIM-3基因,构建原核表达载体,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法:以小鼠脾细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3基因编码区,构建pRSET-B-TIM-3原核表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;然后常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,用Western blot、免疫组化、流式细胞术检测抗体的特异性。结果:成功构建的原核表达载体pRSET-B-TIM-3在大肠杆菌中诱导后可以高效表达TIM-3蛋白;免疫获得的多克隆抗体经过ELISA检测,抗体效价为1∶320 000,经Western blot、免疫组化和流式细胞术等鉴定,抗体的特异性较好。结论:成功克隆出小鼠的TIM-3基因,构建了原核表达载体,制备的兔抗小鼠TIM-3多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定

目的构建胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体。方法用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达。所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白。将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定。结果成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90%以上。ELISA确定抗体效价在1∶50000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。结论成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用

目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性。结果通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体p ET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶6 400 000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性。结论成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体。     

人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建人脂联素球状结构域(gAd)基因的原核表达载体PET-28a(+)-gAd,诱导表达并纯化重组gAd蛋白,制备多克隆抗体。方法:以人基因组为模板,用PCR方法扩增人脂联素球状结构域(gAd)基因,构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经SDS-PAGE,免疫印迹法检测并鉴定表达产物,表达的目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果:原核表达载体PET-28a(+)-gAd转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得gAd重组蛋白,免疫印迹证实能与抗his标签检测抗体结合,制备的多克隆抗体经间接ELISA法测得效价为1∶32 000。免疫印迹证实,抗血清不仅能特异性地识别gAd蛋白,还能识别脂联素蛋白,而不与非特异性蛋白结合。结论:成功构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,并表达、纯化重组蛋白gAd,制备的多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步的研究奠定了基础。     

HIV-1 p15(Gag)基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的 为了研究HIV-1 p15(Gag)的生物学活性,制备HIV-1 p15(Gag)蛋白及其特异性抗体.方法 用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中表达HIV-1 p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的 蛋白.以纯化目的 蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性.结果 原核表达载体pET28 a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约20000的p15(Gag)蛋白经western blot鉴定正确.纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性.结论 得到纯化的HIV-1 p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础.     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。     

人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具.     

结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。     

人T-bet基因的表达、纯化及其免疫原性分析

目的：利用载体pQE30在大肠埃希菌（M15）原核表达人T-bet基因全长序列，并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体。方法：利用PCR技术从克隆载体pGEM-T／T-bet获得人T-bet的全长编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体pQE30，形成重组表达质粒pT-bet；酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109，测序鉴定后转化M15，经IPTG370C诱导4h后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白（表达产物），用Ni^2＋ -IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化；将纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠，制备人T-bet的多克隆抗体。结果：成功表达和纯化了人T-bet，并制备了多克隆抗体，ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价（1：100000）和高度特异性。结论：成功构建了原核表达载体pT-bet，并在工程菌M15中获得大量表达，经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白，制备了效价和特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础。     

人IKKγ基因重组载体的构建及在原核体内的表达纯化

目的构建重组原核表达载体pGEX-5X-1-IKKγ,诱导GST-IKKγ融合蛋白的表达并以GST-pulldown方法得到纯化的融合蛋白。方法应用PCR技术,以M6P8载体为模板扩增得到IKKγ全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5X-1载体中。经酶切、测序鉴定后,重组载体转化至原核细胞中并进行诱导表达,以SDS-PAGE凝胶电泳染色鉴定融合蛋白的表达。融合蛋白经GSTbeads沉降后,Western blot分析、鉴定融合蛋白的表达及纯化情况。结果将人IKKγ亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-1,酶切、测序鉴定无误。经诱导得到高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳染色后可见高表达条带。Westernblot鉴定经GSTbeads沉降后的蛋白,在74kD鉴定出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建了原核表达载体pGEX-5X-1-,并在原核细胞内表达,融合蛋白可以经GSTbeads沉降用于GST-pulldown实验。     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

人CPNE5多克隆抗体的制备

制备人CPNE5的多克隆抗体.将CPNE5基因中423bp(626-1048bp)的片段构建到原核表达载体pGEX-5X-1,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达蛋白,经SDS-PAGE分离纯化得到抗原肽段,质谱法鉴定后常规免疫家兔.用CL-4B柱纯化抗体.结果显示,成功表达并纯化了人CPNE5抗原肽段...     

基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，并表达与纯化融合蛋白，制备其多克隆抗体。方法：通过PCR扩增Myo5a末端一个基因小片段，Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到原核载体pGEX-4T-3，制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a。鉴定后，在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化，重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定。采用融合蛋白免疫家兔，制备其抗血清，测定抗血清效价和特异性。结果：经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功，表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD。免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000，免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性。结论：实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，融合蛋白具备了较高的免疫反应性，并得到了其多克隆抗体，为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫。     

人F1F0-ATP合成酶β亚基的原核表达、纯化及抗体制备

目的: 原核表达、纯化人F1F0-ATP合成酶β亚基(hATP5B)并制备其多克隆抗体.方法: 以人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC) 总RNA为模板, 通过RT-PCR扩增hATP5B 成熟肽编码序列, 克隆入原核表达载体pET28a( ), 转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并诱导表达, 表达产物用Ni2 螯合层析纯化, 纯化产物用透析复性, 产物用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.复性产物免疫家兔, 制备多克隆抗体; 多抗的效价用间接ELISA法检测, 并用Western blot和细胞免疫荧光分析多抗的特异性和抗原结合性.结果: 测序证实获得hATP5B成熟肽编码序列.SDS-PAGE鉴定表明, 表达、纯化、复性产物的相对分子质量(Mr)均约55 000, 与理论值相符.灰度扫描分析重组hATP5B(recombinant hATP5B, rhATP5B)的表达量占菌体蛋白总量的36.8%, 纯化产物纯度达98.3%, 复性产物纯度达99.2%.Western blot反应阳性.多抗的平均抗体效价为1∶640 000, 可特异识别HUVEC中的天然抗原.结论: 原核表达的hATP5B具有良好的免疫原性, 其免疫家兔后获得的多抗具有高效价和特异性.hATP5B的原核高效表达和其抗体制备为进一步研究hATP5B的功能奠定了实验基础.     

新疆出血热病毒核蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学评价

目的 原核细胞中表达、纯化新疆出血热病毒BA88166毒株核蛋白(NP)并制备及鉴定抗NP蛋白的多克隆抗体.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出BA88166毒株S基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-32a上,形成重组原核表达质粒pET-88166S.构建好的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化NP-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量(Mr).用该纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性.结果 双酶切鉴定和DNA测序证实构建的pET-88166S重组表达载体正确,目的基因序列与GenBank中公布的序列一致,在E.coli BL21中表达的NP-His融合蛋白经SDS-PAGE分析,其Mr约为66000.ELISA检测抗体效价高于1:25600,蛋白免疫印迹实验结果表明抗体能特异性识别新疆出血热病毒YL04057毒株的NP蛋白及其截短蛋白.结论 成功获得新疆出血热病毒NP-His融合蛋白,得到了特异性兔抗NP蛋白多克隆抗体.     

牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。